碧云天的尿素酶活性检测试剂盒(显色法) (Urease Activity Assay Kit, Colorimetric)，又称脲酶活性检测试剂盒，是一种基于靛酚法，通过吸光度检测，快速、灵敏地检测血清、血浆、尿液等各物种生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清样品、纯化的酶、土壤等样品中尿素酶活性的试剂盒。

尿素酶(Urease, EC3.5.1.5)，又称脲酶、大豆酵素，是一种含有二价镍离子的高分子量金属酶，能特异性催化尿素水解为二氧化碳和氨，在功能上属于酰胺水解酶和磷酸三酯酶超家族[1-2]。尿素酶存在于许多细菌、真菌、藻类、植物和一些无脊椎动物中。尿素酶通常可与肝性脑病/肝昏迷、感染性尿路结石和消化性溃疡有关。感染所致的尿路结石为鸟粪石(MgNH4PO4·6H2O)和碳酸磷灰石[Ca10(PO4)6·CO3]的混合物。这些多价离子是可溶性的，但在尿素水解过程中当微生物尿素酶产生氨时会析出，因为氨的产生会使周围环境pH从大约6.5增加到9，这种环境的碱化可导致结石结晶形成[3]。许多胃肠道或泌尿道病原体都能产生尿素酶，因此尿素酶的检测成为诊断病原体的重要手段。

本试剂盒检测原理如图1所示。在尿素酶的催化作用下，尿素水解生成二氧化碳(CO2)和氨气(NH3)，生成的氨气和次氯酸盐(OCl-)形成氯胺(Monochloramine)，氯胺进一步与酚(Phenol)反应形成蓝色的吲哚酚(Indophenols)。吲哚酚在670nm左右有最大吸收峰，吲哚酚的生成量与样品中尿素酶的活性成正比，这样通过670nm处的吸光度检测就可以非常灵敏地检测尿素酶的酶活性。

图1.碧云天尿素酶活性检测试剂盒(显色法) (S0577)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为10µl时可以检测低至约2mU/ml的尿素酶，在0.002-0.167U/ml (2-167mU/ml)范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了尿素酶催化生成的产物氨标准溶液(NH4Cl Standard)，可以通过设置标准曲线(图2)，计算出样品中尿素酶活力。通常0.5-10μl细胞或组织裂解液样品足够用于尿素酶的活性检测。

图2.碧云天尿素酶活性检测试剂盒(显色法) (S0577)对氯化铵标准品、阳性对照、HeLa细胞裂解液样品的检测效果图。10µl各浓度的氯化铵标准品及阳性对照、HeLa细胞裂解样品，加入90µl尿素酶检测工作液混匀后，37ºC孵育30分钟，再依次加入50µl Detection Reagent A、100µl Detection Reagent B，混匀，37ºC孵育30分钟，测定A670。左图为本试剂盒对氯化铵标准品的检测效果图，在0.05-5mM浓度范围内有良好的线性关系；右图为本试剂盒检测阳性对照(Positive Control)和7μg蛋白量的HeLa细胞裂解液样品(HeLa Cell)的信号值。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒对Assay Buffer、孵育温度和试剂用量等条件进行了优化，不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统，可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液、细胞培养上清以及组织或细胞等样品的检测，也可用于纯化的尿素酶和土壤中尿素酶活性的检测。对于大多数样品，全程约1小时即可完成。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0577S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0577S-2	Urease Assay Buffer	20ml
S0577S-3	Detection Reagent A	5ml
S0577S-4	Detection Reagent B	10ml
S0577S-5	Substrate (10X)	1ml
S0577S-6	Positive Control (10X)	50μl
S0577S-7	NH4Cl Standard (100mM)	100μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中Detection Reagent A和Detection Reagent B须避光保存。

注意事项：

如果需要检测土壤样品中的尿素酶活性，需自备50mM 乙酸钠(pH5.0)作为提取液。土壤样品的制备、样品和样品背景对照的设置以及尿素酶活性的计算都比较特殊，与常规的血液、组织和细胞样品存在一定差异，请严格按照说明书中相关说明进行操作和计算。

Detection Reagent B在空气中不太稳定，开启后应尽快使用，且在使用过程中需注意避光。

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay Buffer、Urease Assay Buffer、Detection Reagent A和Detection Reagent B需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它试剂使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

如果使用本试剂盒提供的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay Buffer制备样品，并且加入的样品量在本试剂盒的推荐范围内，可以确保反应体系的pH值在适宜的范围内。如果使用自行配制的裂解液，请确保加入样品后反应体系的pH值在7.0左右，否则可能会影响尿素酶的检测。

体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再混匀使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。

血清、细胞等裂解样品如果置于4ºC保存，用于尿素酶活性检测时，宜在当天完成检测，否则可能会影响检测结果的准确性。通常细胞或组织裂解样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

Detection Reagent A和Detection Reagent B对人体有害或有刺激性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备。
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
d.土壤样品的准备：本步骤仅供参考，可根据实际情况进行适当的调整和优化，例如适当降低土壤样品的量(其它相关溶液的量也需要相应的降低、实际反应的土壤的重量也需要重新计算)等。
(a)称取0.1g土壤样品，加入2ml 50mM 乙酸钠(pH5.0)，使用适当的匀浆仪在约4ºC或冰浴等低温条件下匀浆2分钟。
(b)充分振荡混匀后，取0.9ml至一洁净的离心管中作为样品；另取0.2ml至另一洁净的离心管中作为样品背景对照。
(c)在样品管中加入0.1ml的尿素酶检测工作液(步骤2b)，并在37ºC孵育2小时，8000×g离心1分钟；样品背景对照管直接在8000×g离心1分钟。样品管和样品背景对照管分别取0.1ml上清液并加入到96孔板的样品孔和样品背景对照孔中，直接转步骤3e。
注：土壤样品中尿素酶的活性可能比较低，为确保活性在检测范围内，建议进行多个孵育时间的测试，孵育时间可以从1小时到24小时不等。
2.试剂盒的准备。
a.将BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay Buffer、Urease Assay Buffer、Detection Reagent A和Detection Reagent B平衡至室温后分别混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.尿素酶检测工作液(Urease Working Solution)的配制：按照每个样品需90µl尿素酶检测工作液的比例配制适量的尿素酶检测工作液。均匀混合81µl Urease Assay Buffer、9µl Substrate (10X)，即可配制成90µl尿素酶检测工作液。根据待检测样品(不包括标准品和样品背景对照孔)的数量，配制适量的尿素酶检测工作液。具体配制方法参考下表。配制好的尿素酶检测工作液可以短暂冰浴避光保存，1小时内较为稳定，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Urease Assay Buffer (µl)	81	810	1620	4050
Substrate (10X) (µl)	9	90	180	450
Urease Working Solution (µl)	90	900	1800	4500

3.样品测定。
a.氯化铵标准曲线的设置。
取10μl NH4Cl Standard (100mM)，加入190μl Urease Assay Buffer，混匀，配制成浓度为5mM氯化铵标准溶液。分别取5mM氯化铵溶液0、0.2、0.4、1、2、4、10μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用Urease Assay Buffer补足至10μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5mM (用于常规样品的计算)，对应的摩尔数分别为0、1、2、5、10、20、50nmol (用于土壤样品的计算)。
b.阳性对照的设置。取适量的Positive Control (10X)，按照1:9的比例加入Urease Assay Buffer将其稀释成1X，例如取Positive Control (10X) 2μl，加入Urease Assay Buffer 18μl，混匀即得20μl的Positive Control (1X)。用作阳性对照时，每孔使用10μl。
c.取1-10μl样品或稀释后的样品到96孔板样品孔(Sample)和样品背景对照中，并加入Urease Assay Buffer补足到10µl。同时设置仅含Urease Assay Buffer的孔为空白对照(Blank Control)。
注1：为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数，以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者样品的量。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了5倍稀释，加入的“稀释后的样品”为2µl，则n=5×10/2=25)。
注2：对于血清、组织裂解液上清等复杂样品，建议将适当样品设置多个稀释倍数进行预实验，在适当的稀释倍数时，样品的信号值和样品中的蛋白量通常会呈现出良好的线性关系。再根据预实验的结果，选取适宜的稀释倍数用于后续的测定，否则即使信号值在标准曲线的线性范围内，也可能无法得到理想的检测结果。
注3：土壤样品和样品背景对照的设置参照步骤1d (c)。
d.样品孔、空白对照孔和阳性对照孔各孔加入90μl尿素酶检测工作液，标准品孔和样品背景对照孔各孔加入90μl Urease Assay Buffer。混匀，37ºC孵育30分钟。
注：对于活性较低的样品，可以适当延长孵育时间至60分钟到2小时。
e.各孔(包括样品孔、样品背景对照孔、空白对照孔、阳性对照孔和标准品孔)加入50µl Detection Reagent A，混匀。
f.各孔(包括样品孔、样品背景对照孔、空白对照孔、阳性对照孔和标准品孔)再加入100µl Detection Reagent B，混匀，37ºC避光孵育30分钟。
g.在670nm测定吸光度。
h.尿素酶活性的计算。
(a)常规样品中尿素酶活性的计算：建立氯化铵标准曲线(摩尔浓度，单位为mM)，并计算反应时间内样品中尿素酶催化产生的铵根离子的量A。氯化铵标准曲线可以参考图2，在0.05-5mM范围内有良好的线性关系。
Urease Activity (U/ml)=A×n/T
注：A为步骤3h (a)根据标准曲线确定的铵根离子的浓度(mM)；
n为步骤3c样品总稀释倍数；
T为步骤3d的反应时间(min)；
尿素酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(unit, U)在37ºC，pH7.0的条件下，每分钟内可以催化生成1µmol氨。
(b)土壤样品中尿素酶活性的计算：建立氯化铵标准曲线(摩尔数，单位为nmol)，并计算反应时间内样品中尿素酶催化产生的铵根离子的量B。
Urease Activity (nmol/mg soil/hour)=B/(T×5)
注：A为步骤3h (b)根据标准曲线确定的铵根离子的摩尔数(nmol)；
5为实际反应的土壤的重量约5mg；
T为步骤1d的反应时间(hours)。
参考文献：
1.Holm L, Sander C. Proteins. 1997. 28(1):72-82.
2.Krajewska B, van Eldik R, Brindell M. J Biol Inorg Chem. 2012. 17(7):1123-1134.
3.Mobley HL, Hausinger RP. Microbiol Rev. 1989. 53(1):85-108.
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