N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(显色法)
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产品编号 S0538S
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碧云天研发的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(显色法) (N-Acetylglucosaminidase Activity Assay Kit, Colorimetric),简称NAG检测试剂盒(NAG Assay Kit),是一种用比色法,快速、高灵敏地对血清、血浆和尿液等生物体液、组织和细胞裂解液以及细胞培养上清等样品中N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性进行检测的试剂盒。

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(N-Acetylglucosaminidase, NAG)是一种位于细胞溶酶体的酸性糖苷酶,可水解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷和β-N-乙酰氨基半乳糖苷,广泛存在于各种组织器官、体液和血细胞中,在肾小管和泌尿道上皮细胞内含量特别丰富[1]。因为其分子量大,正常情况下血清中的NAG不能通过肾小球滤过,在尿液中的含量是很低的。当肾脏病变时,NAG在尿液中的排出量会增加,因此尿NAG测定是检测肾损伤,特别是肾小管缺血、坏死的敏感指标[2]。尿液中NAG升高常见于肾小球肾炎、肾小管-间质病变、先天性肾小管病变、肾移植排斥期及狼疮肾等。因休克引起的急性肾衰,尿液中NAG酶可高达正常值的1200倍。在肾移植术后发生的排异反应中,该酶在一般肾功能检查确诊为排异反应前3周即可出现。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性检测对于临床相关疾病的诊断、预防和治疗等具有重要的意义[2]。

本试剂盒的检测原理如图1所示。在酸性条件下,N-乙酰氨基葡萄糖苷酶将底物对硝基苯酚-N-乙酰氨基葡萄糖苷(p-Nitrophenyl-N-acet-glucosaminide)水解生成游离的对硝基苯酚(p-Nitrophenol),在碱性条件下,对硝基苯酚呈黄色,在400nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的黄色产物的量与样品中N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性成正比。

图1.碧云天N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(显色法) (S0538)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高,线性范围宽,样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时可以检测浓度低至13µU的酶,在0.67-66.7U/L活力范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的作用产物对硝基苯酚的标准溶液,可以通过设置标准曲线(图2),计算出样品中的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活力。

图2.碧云天N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(显色法) (S0538)检测对硝基苯酚的标准曲线及小鼠肝脏样品的检测效果。左图为本试剂盒对标准品对硝基苯酚的检测效果,在20-2000μM浓度范围内有良好的线性关系;右图为对不同蛋白量的小鼠肝脏裂解液样品的检测效果图,反应时间为30分钟。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品,也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测,通用性强;,而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒检测速度快,适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液,细胞培养上清及组织或细胞裂解液样品等的检测,全程约0.5-1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样本的检测,也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作,用于96孔板检测时,本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
S0538S-1 BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay 25ml
S0538S-2 NAG检测缓冲液 25ml
S0538S-3 底物 210μl
S0538S-4 反应终止液 12ml
S0538S-5 对硝基苯酚标准溶液(50mM) 200μl
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。其中底物、对硝基苯酚标准溶液须避光保存。所有试剂避免反复冻融。

注意事项:

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、NAG检测缓冲液(后续简称检测缓冲液)和反应终止液需要完全解冻并平衡至室温后再使用,否则会影响检测结果。其它试剂在使用时应在冰上进行。

血清等样品如在4ºC保存,保存时间不得超过2周,否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20ºC保存,-80ºC保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.样品的准备:
a.血液样品的准备:对于血清样品,将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时,不要剧烈摇晃以免溶血,待全血自然凝固并析出血清后,4ºC约1000-2000×g离心10分钟,取黄色上清即得血清,注意不要吸取白色或淡黄色沉淀;对于血浆样品,将全血用肝素或者EDTA进行抗凝,4ºC约1000-2000×g离心10分钟,取黄色或淡黄色上清即得血浆,注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上,如果不能立即检测,也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品,在检测前解冻后冰浴存放备用,使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备:对于培养的贴壁细胞,PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞,先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内,弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液,适当吹打,冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟,取上清用于后续检测。对于组织样品,按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例,使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟,取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测,可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备:对于贴壁细胞,直接取培养液;对于悬浮细胞,离心取培养液。
2.试剂盒的准备:
a.BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、检测缓冲液和反应终止液,平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用,使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.底物工作液(Working Solution)的配制:按照每个检测反应80μl的体积配制适量的底物工作液。均匀混合78μl检测缓冲液(NAG Assay Buffer)、2μl底物(Substrate),即可配制成80μl底物工作液(Working Solution)。根据待检测样品(包括标准品和对照)的数量,配制适量的底物工作液。具体配制方法参考下表。
Samples 1 10 20 50
NAG Assay Buffer (μl) 78 780 1460 3900
Substrate (μl) 2 20 40 100
Working Solution (μl) 80 800 1600 4000
3.对硝基苯酚标准曲线的准备:
取4μl对硝基苯酚标准溶液(50mM),加入96μl检测缓冲液,混匀,配制成100μl浓度为2mM的对硝基苯酚标准溶液。再分别取2mM的对硝基苯酚标准溶液3.125、6.25、12.5、25、50μl,并用检测缓冲液补足到50μl。此时标准品的浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2mM。检测时96孔板中每孔加入20μl的标准品,并设置20微升检测缓冲孔作为浓度为0的孔。
4.样品测定:
a.参考下表使用96孔板设置标准品孔、样品孔和样品对照孔。并按下表依次加入标准品(Standard)、待测样品(Sample)、终止液(Stop Solution)和底物工作液(Substrate Working Solution),混匀。
注:不同样品中NAG的活性水平差别可能会比较大,为确保数值在标准曲线范围内,可以进行预实验将样品同时设定不同的稀释倍数,以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内,可调整样品的稀释倍数或增加样品的用量。样品稀释倍数记为n。
标准品(Standard) 样品(Sample) 样品对照(Blank)
Standard (μl) 20 - -
Sample (μl) - 20 20
Stop Solution (μl) - - 100
Substrate Working Solution (μl) 80 80 80
b.37ºC孵育30分钟,反应时间记为T。
注:为取得最佳的检测效果,孵育时间可以根据样品中NAG活性进行调整,但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于NAG活性较高的样品,可以缩短孵育时间为10到15分钟;对于NAG活性较低的样品,可以延长孵育时间至45到60分钟。
c.除样品对照的各孔加入反应终止液100μl,混匀。
d.37ºC孵育10分钟,测定A400,ΔA = Asample - ABlank
e.建立对硝基苯酚标准曲线,将ΔA代入标准曲线,即可计算出在反应时间内样品中NAG催化产生的对硝基苯酚的浓度(记录为B)。对硝基苯酚标准曲线可以参考图2,在20-2000μM浓度范围内有良好的线性关系。样品中NAG活性计算公式如下:
N-Acetylglucosaminidase Activity (U/L) = B × n / T
注:B为步骤4e根据标准曲线确定的对硝基苯酚浓度(µM);
n为步骤4a样品稀释倍数;
T为步骤4b的反应时间(min)。
NAG活力单位的定义:1个酶活力单位(unit, U)在37ºC条件下,在1分钟内可以将1µmol对硝基苯酚-N-乙酰氨基葡萄糖苷转化成对硝基苯酚和N-乙酰氨基葡萄糖苷。
参考文献:
1.von Figura K. Eur J Biochem. 1977. 80(2):535-542.
2.Mohamed Ali OS, Elshaer SS, Anwar HM, Zohni MSE. J Biochem Mol Toxicol. 2017. 31(11).
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