碧云天研发的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(显色法) (N-Acetylglucosaminidase Activity Assay Kit, Colorimetric)，简称NAG检测试剂盒(NAG Assay Kit)，是一种用比色法，快速、高灵敏地对血清、血浆和尿液等生物体液、组织和细胞裂解液以及细胞培养上清等样品中N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性进行检测的试剂盒。

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(N-Acetylglucosaminidase, NAG)是一种位于细胞溶酶体的酸性糖苷酶，可水解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷和β-N-乙酰氨基半乳糖苷，广泛存在于各种组织器官、体液和血细胞中，在肾小管和泌尿道上皮细胞内含量特别丰富[1]。因为其分子量大，正常情况下血清中的NAG不能通过肾小球滤过，在尿液中的含量是很低的。当肾脏病变时，NAG在尿液中的排出量会增加，因此尿NAG测定是检测肾损伤，特别是肾小管缺血、坏死的敏感指标[2]。尿液中NAG升高常见于肾小球肾炎、肾小管-间质病变、先天性肾小管病变、肾移植排斥期及狼疮肾等。因休克引起的急性肾衰，尿液中NAG酶可高达正常值的1200倍。在肾移植术后发生的排异反应中，该酶在一般肾功能检查确诊为排异反应前3周即可出现。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性检测对于临床相关疾病的诊断、预防和治疗等具有重要的意义[2]。

本试剂盒的检测原理如图1所示。在酸性条件下，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶将底物对硝基苯酚-N-乙酰氨基葡萄糖苷(p-Nitrophenyl-N-acet-glucosaminide)水解生成游离的对硝基苯酚(p-Nitrophenol)，在碱性条件下，对硝基苯酚呈黄色，在400nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的黄色产物的量与样品中N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性成正比。

图1.碧云天N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(显色法) (S0538)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时可以检测浓度低至13µU的酶，在0.67-66.7U/L活力范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的作用产物对硝基苯酚的标准溶液，可以通过设置标准曲线(图2)，计算出样品中的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活力。

图2.碧云天N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(显色法) (S0538)检测对硝基苯酚的标准曲线及小鼠肝脏样品的检测效果。左图为本试剂盒对标准品对硝基苯酚的检测效果，在20-2000μM浓度范围内有良好的线性关系；右图为对不同蛋白量的小鼠肝脏裂解液样品的检测效果图，反应时间为30分钟。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；，而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清及组织或细胞裂解液样品等的检测，全程约0.5-1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0538S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	25ml
S0538S-2	NAG检测缓冲液	25ml
S0538S-3	底物	210μl
S0538S-4	反应终止液	12ml
S0538S-5	对硝基苯酚标准溶液(50mM)	200μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中底物、对硝基苯酚标准溶液须避光保存。所有试剂避免反复冻融。

注意事项：

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、NAG检测缓冲液(后续简称检测缓冲液)和反应终止液需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它试剂在使用时应在冰上进行。

血清等样品如在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、检测缓冲液和反应终止液，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.底物工作液(Working Solution)的配制：按照每个检测反应80μl的体积配制适量的底物工作液。均匀混合78μl检测缓冲液(NAG Assay Buffer)、2μl底物(Substrate)，即可配制成80μl底物工作液(Working Solution)。根据待检测样品(包括标准品和对照)的数量，配制适量的底物工作液。具体配制方法参考下表。

Samples	1	10	20	50
NAG Assay Buffer (μl)	78	780	1460	3900
Substrate (μl)	2	20	40	100
Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

3.对硝基苯酚标准曲线的准备：
取4μl对硝基苯酚标准溶液(50mM)，加入96μl检测缓冲液，混匀，配制成100μl浓度为2mM的对硝基苯酚标准溶液。再分别取2mM的对硝基苯酚标准溶液3.125、6.25、12.5、25、50μl，并用检测缓冲液补足到50μl。此时标准品的浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2mM。检测时96孔板中每孔加入20μl的标准品，并设置20微升检测缓冲孔作为浓度为0的孔。
4.样品测定：
a.参考下表使用96孔板设置标准品孔、样品孔和样品对照孔。并按下表依次加入标准品(Standard)、待测样品(Sample)、终止液(Stop Solution)和底物工作液(Substrate Working Solution)，混匀。
注：不同样品中NAG的活性水平差别可能会比较大，为确保数值在标准曲线范围内，可以进行预实验将样品同时设定不同的稀释倍数，以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或增加样品的用量。样品稀释倍数记为n。

	标准品(Standard)	样品(Sample)	样品对照(Blank)
Standard (μl)	20	-	-
Sample (μl)	-	20	20
Stop Solution (μl)	-	-	100
Substrate Working Solution (μl)	80	80	80

b.37ºC孵育30分钟，反应时间记为T。
注：为取得最佳的检测效果，孵育时间可以根据样品中NAG活性进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于NAG活性较高的样品，可以缩短孵育时间为10到15分钟；对于NAG活性较低的样品，可以延长孵育时间至45到60分钟。
c.除样品对照的各孔加入反应终止液100μl，混匀。
d.37ºC孵育10分钟，测定A400，ΔA = Asample - ABlank
e.建立对硝基苯酚标准曲线，将ΔA代入标准曲线，即可计算出在反应时间内样品中NAG催化产生的对硝基苯酚的浓度(记录为B)。对硝基苯酚标准曲线可以参考图2，在20-2000μM浓度范围内有良好的线性关系。样品中NAG活性计算公式如下：
N-Acetylglucosaminidase Activity (U/L) = B × n / T
注：B为步骤4e根据标准曲线确定的对硝基苯酚浓度(µM)；
n为步骤4a样品稀释倍数；
T为步骤4b的反应时间(min)。
NAG活力单位的定义：1个酶活力单位(unit, U)在37ºC条件下，在1分钟内可以将1µmol对硝基苯酚-N-乙酰氨基葡萄糖苷转化成对硝基苯酚和N-乙酰氨基葡萄糖苷。
参考文献：
1.von Figura K. Eur J Biochem. 1977. 80(2):535-542.
2.Mohamed Ali OS, Elshaer SS, Anwar HM, Zohni MSE. J Biochem Mol Toxicol. 2017. 31(11).
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