碧云天研发的黄嘌呤氧化酶活性检测试剂盒(WST-8法)，即Xanthine Oxidase Activity Assay Kit with WST-8，也称XO Activity Assay Kit with WST-8或XOD Activity Assay Kit with WST-8，是一种基于WST-8的显色反应，利用吸光度检测，简单、快速、灵敏地用于血清、血浆、尿液等生物体液、组织、细胞以及细胞培养上清等样品中黄嘌呤氧化酶活性检测的试剂盒。通常0.2-1μl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的检测。

黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase, XO or XOD)是体内核酸代谢中的一种重要酶，可以催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，并能进一步催化黄嘌呤氧化为尿酸，同时产生过氧化氢以及超氧化物阴离子的一系列氧化反应，在包括人类在内的一些物种中的嘌呤分解代谢中起着重要作用[1]。在人类及其它灵长类动物中，XO通常存在于血清、肺、肝脏和肠黏膜中。在啮齿类动物中，XO在大部分组织中均有表达。血液中XO的活性通常都很低。当感染甲型流感时，血清及肺部的XO活性会增加[2]。当肝功能受损时，XO会大量释放到血液中，因此检测血液中XO水平被作为一个评估严重肝损伤(例如黄疸)的灵敏指标[3]。

本试剂盒的检测原理请参考图1。底物(Substrate)在XO催化作用下产生的超氧化物阴离子(O2.-)，随后与WST类指示剂(Indicator)反应产生水溶性的甲臜染料(Formazan dye)。甲臜染料在450nm左右有最大吸收峰，甲臜染料的生成量与黄嘌呤氧化酶的活性成正比，通过测定450nm处的吸光度就可以非常灵敏地检测样品中黄嘌呤氧化酶活性。

图1.碧云天黄嘌呤氧化酶活性检测试剂盒(WST-8法) (S0110)的原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时，可以检测活性低至4µU的黄嘌呤氧化酶，在0.2-30mU/ml (4-600µU)活性范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了配制黄嘌呤氧化酶标准溶液的XO (2U/ml)，可以通过绘制标准曲线(图2)，从而计算出样品中的黄嘌呤氧化酶的活性。如果样品量较少或者样品中黄嘌呤氧化酶的活性较低，可以使用检测灵敏度更高的Amplex Red黄嘌呤氧化酶活性检测试剂盒(S0112)。

图2.碧云天黄嘌呤氧化酶活性检测试剂盒(WST-8法) (S0110)对黄嘌呤氧化酶标准品及小鼠不同组织样品的检测效果图。左图为黄嘌呤氧化酶的标准曲线图，各浓度的黄嘌呤氧化酶标准品和Chromogen Working Solution混匀后，37ºC反应30分钟，测定A450，在0.2-30mU/ml活性范围内有良好的线性关系。右图为10mU/ml黄嘌呤氧化酶、 320µg蛋白量的小鼠肝脏(Mouse liver)裂解样品、125µg蛋白量的小鼠肌肉(Mouse muscle)裂解样品加入Chromogen Working Solution并匀混后，在37ºC反应30分钟内的吸光度信号变化图。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；，而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测，全程约0.5-1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒的小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0110S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	30ml
S0110S-2	XO Assay Buffer	30ml
S0110S-3	XO (2U/ml)	25µl
S0110S-4	XO Indicator (100X)	100µl
S0110S-5	XO Substrate	150µl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。XO Indicator须避光保存。

注意事项：

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、XO Assay Buffer、XO Indicator需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。XO使用时应在冰上进行，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒保存的条件进行保存。

血清等样品如在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

为减少稀释液产生的背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释；当样品为血液等其它样品时，应使用XO Assay Buffer稀释。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例, 使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解除XO以外的其它所有试剂并平衡至室温。XO置于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.Chromogen Working Solution的配制：按照每个样品需要80μl Chromogen Working Solution的量配制适量的Chromogen Working Solution。均匀混合77.5μl XO Assay Buffer、1μl XO Indicator (100X)、1.5μl XO Substrate，即可配制成80μl Chromogen Working Solution。具体配制方法参考下表。配制好的Chromogen Working Solution如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
XO Assay Buffer (μl)	77.5	775	1550	3875
XO Indicator (100X) (μl)	1	10	20	50
XO Substrate (μl)	1.5	15	30	75
Chromogen Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

3.样品测定：
a.黄嘌呤氧化酶标准曲线的设置：取3μl XO (2U/ml)，加入197μl XO BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或XO Assay Buffer (如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等无需处理的样品，使用XO Assay Buffer)，混匀，即得浓度为30mU/ml的XO。分别取30mU/ml的XO 1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用对应的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或XO Assay Buffer补足至20μl，此时标准曲线的浓度为0、1.5、3、6、12、18、24、30mU/ml。
b.取1-20μl稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地再加入BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或XO Assay Buffer至样品孔中，补足到20µl。同时设置仅含BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或XO Assay Buffer的孔为空白对照孔。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议将样品同时设定多个稀释倍数。可以进行预实验确定样品的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者增加样品的用量。如果是BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释；如果是血液、上清等无需处理的样品，使用XO Assay Buffer稀释。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=10×20/10=20)。
c.各孔加入Chromogen Working Solution 80μl，混匀，37ºC反应30分钟。注：如果吸光度偏低，可适当延长反应时间。
d.在450nm测定吸光度。
e.建立标准曲线，并计算样品中黄嘌呤氧化酶的活性A。黄嘌呤氧化酶标准曲线可以参考图2，在0.2-30mU/ml活性范围内有良好的线性关系。黄嘌呤氧化酶酶活性计算公式如下：
C (mU/ml) = A × n
注：A为步骤3e根据标准曲线确定的黄嘌呤氧化酶活性；
n为步骤3b样品总稀释倍数。
黄嘌呤氧化酶酶活性单位的定义为：在室温条件下，每分钟催化黄嘌呤产生1.0μmol尿酸和过氧化氢所需的酶量。
参考文献：
1.Hille R, Hall J, Basu P. Chem Rev. 2014. 114(7):3963-4038.
2.Hemilä H. Br J Nutr. 1992. 67(1):3-16.
3.Battelli MG, Musiani S, Valgimigli M, Gramantieri L, Tomassoni F, et al. Am J Gastroenterol. 2001. 96(4):1194-1199.
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