碧云天研发的酸性磷酸酶检测试剂盒(荧光法)，即Acid Phosphatase Assay Kit (Fluorometric)，简称ACP检测试剂盒，是一种使用荧光法快速、高灵敏地检测血清或血浆等生物体液、细胞培养上清以及细胞或组织裂解液等样品中酸性磷酸酶活性的试剂盒。通常0.1-1μl血清或血浆样品足够用于本试剂盒的检测。

酸性磷酸酶(Acid Phosphatase, ACP)，也称酸性磷酸酯酶，是一种在溶酶体中含量较高的酸性水解酶，被认为是鉴定溶酶体亚细胞组分的标志物。酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD到100kD不等。血浆中的酸性磷酸酶活性范围在2-7.9U/L，血清中酸性磷酸酶的活性范围在2.5-11.7U/L。精液中含有高浓度的酸性磷酸酶，活力可以达到87-436KU/L。酸性磷酸酶主要分为两类，一类为抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)，一类为抗氟离子酸性磷酸酶(Fluoride resistant acid phosphatase, FRAP)。

TRAP被认为是一种用于类风湿关节炎等慢性炎症性疾病、骨代谢紊乱、骨转移癌症的临床诊断生物标志物，对监测治疗反应、评估转移性癌症患者的预后情况有重要作用[1-2]。在内脏转移的乳腺癌患者、卵巢癌以及恶性黑色素瘤患者的血清中，TRAP的活性升高[3]。FRAP在前列腺中的表达水平非常高，当前列腺发生癌变并出现转移时，抗氟离子的前列腺特异性酸性磷酸酶(Prostatic acid phosphatase)活性水平最高。当前列腺发生病变时会导致血液中FRAP活性显著升高。因此，血清或血浆中FARP活性水平的升高，常被用作前列腺癌等前列腺病变的指标[4]。此外，溶酶体储存性疾病(Lysosomal storage diseases)如Gaucher's disease等，也会导致血液中FRAP活性水平一定程度的升高[5]。

本试剂盒的检测酸性磷酸酶的原理如图1所示。在酸性条件下，4-甲基伞形酮磷酸酯二钠盐(4-Methylumbelliferyl phosphate, 4-MUP)在酸性磷酸酶的作用下，被水解为4-甲基伞形酮(4-Methylumbelliferone, 4-MU)和磷酸盐(Phosphate)。生成的4-MU呈蓝色荧光，激发波长为360nm，发射波长为450nm。酸性磷酸酶的荧光强度与其催化产生的4-MU的量成正比，通过检测4-MU的荧光强度最终计算出酸性磷酸酶的活性。

图1.碧云天酸性磷酸酶检测试剂盒(荧光法) (P0327)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。相较于酸性磷酸酶检测试剂盒(P0326)，本试剂盒的检测灵敏度更高、检测方法更加灵活。本试剂盒在样品体积为20μl时可检测浓度低至0.008U/L的酸性磷酸酶，在0.008-32U/L活力范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了酸性磷酸酶反应产物4-MU的标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2A)，计算出样品中酸性磷酸酶的活性。

图2.碧云天酸性磷酸酶检测试剂盒(荧光法) (P0327)对4-MU标准品、阳性对照、HeLa细胞和小鼠不同组织样品检测效果图。图2A为本试剂盒对4-MU标准品的检测效果图，在0.005-20nmol范围内有较好线性关系；图2B为本试剂盒检测2.5μg蛋白量HeLa细胞(HeLa cell)裂解液、8μg蛋白量小鼠肝脏(Mouse liver)裂解液、12μg蛋白量小鼠腿肌样品(Mouse muscle)裂解液、阳性对照(Positive Control)时反应30分钟的荧光检测效果。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒检测使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞裂解液样品等的检测。整个检测过程约1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用操作说明，用于96孔板进行检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
P0327S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
P0327S-2	ACP Assay Buffer	15ml
P0327S-3	MUP Substrate (100X)	100μl
P0327S-4	Positive Control (100X)	20μl
P0327S-5	4-MU (50mM)	50μl
P0327S-6	Stop Solution	10ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中4-MU须避光保存。所有试剂避免反复冻融。

注意事项：

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、ACP Assay Buffer、MUP Substrate (100X)、4-MU (50mM)、Stop Solution需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它试剂使用时应在冰上进行。

血清等样品如在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

样品溶液中须避免出现EDTA、酒石酸盐、氟离子、草酸盐、柠檬酸盐等酸性磷酸酶的抑制剂。

Stop Solution有腐蚀性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或腐蚀其他物品。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的制备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100μl-200μl的比例加入BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、Tissue Master™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下匀浆。将匀浆液在4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备工作：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、ACP Assay Buffer、Stop Solution、MUP Substrate (100X)、4-MU (50mM)、平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.MUP Substrate工作液的配制：按照每个反应80µl的体积配制适量的MUP Substrate工作液。取10μl MUP Substrate (100X)加入990μl ACP Assay Buffer，混匀，即可配制成1ml的MUP Substrate工作液。根据待检测样品的数量，配制适量的MUP Substrate工作液。配制好的MUP Substrate工作液如果置于4ºC或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。
3.样品测定：
a.4-MU标准曲线的设置。
取2μl 4-MU (50mM)，加入98μl ACP Assay Buffer，混匀，配制成100μl浓度为1mM的4-MU标准溶液。分别取1mM的4-MU标准溶液0、0.2、0.5、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用ACP Assay Buffer补足至20μl，此时，标准曲线的各孔4-MU的浓度和物质的量分别为0、10、25、50、100、250、500、1000μM或0、0. 2、0. 5、1、2、5、10、20nmol。
注：初次检测，可以按照以上浓度设置标准曲线。在后续的实验中，可以根据样品中酸性磷酸酶的活性对标准品的浓度范围进行适当调整。
b.阳性对照的设置。
取适量的Positive Control (100X)，用ACP Assay Buffer将其100倍稀释，然后取20μl加入96孔板作为阳性样品。例如取阳性对照(100X) 1μl，加入ACP Assay Buffer 99μl，混匀后取20μl加入96孔板作为阳性样品。
注：由于Positive Control (100X)的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
c.取1-20μl稀释后的样品至96孔板样品孔中，并再加入ACP Assay Buffer补足到20µl，同时设置仅含ACP Assay Buffer的孔为空白对照孔。此处的样品体积记为Sv。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议样品同时设定多个稀释倍数，可以进行预实验确定样品的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者增加样品的量。此处的样品稀释倍数记为n。
d.除4-MU标准曲线外的其余各孔中加入MUP Substrate工作液80μl，4-MU标准曲线各孔加入ACP Assay Buffer 80μl，混匀。
e.37ºC避光孵育20-60分钟，反应时间记录为T。
注：为取得最佳的检测结果，反应时间可以根据待测样品中的酸性磷酸酶活性进行调整，但必须确保读数在标准曲线的范围之内。对于酸性磷酸酶活性较高的样品，反应时间可以设为20或30分钟。对于酸性磷酸酶活性较低的样品，反应时间可以设为45分钟或1小时。
f.各孔中立即加入50μl Stop Solution，混匀。
注：如果孔数较多，可以在低温操作或使用排枪操作以减小各孔间加入Stop Solution的时间差而导致的误差，混匀也宜在培养板振荡器上进行。
g.设置酶标仪激发波长为360nm、发射波长为450nm进行荧光强度检测，记为F。
h.建立4-MU标准曲线，将F代入标准曲线，即可计算出反应时间内样品中酸性磷酸酶催化产生的4-MU的量(记为Sa)。4-MU标准曲线可以参考图2A，在0.005-20nmol范围内有良好的线性关系。ACP活性计算公式如下：
ACP Activity (U/L) = Sa × n / (T × Sv)
注：Sa为步骤3h根据标准曲线确定的4-MU生成量(nmol)；
n为步骤3c样品稀释倍数；
T为步骤3e的反应时间(min)；
Sv为步骤3c中的样品体积(ml)。
酸性磷酸酶的活力定义：一个酶活力单位(Unit, U)在25或37ºC，pH4.8的条件下，1分钟内可以生成1μmol的4-MU。
参考文献：
1.Anand A, Srivastava PK. Appl Biochem Biotechnol. 2012. 167(8):2174-97.
2.Janckila AJ, Neustadt DH, Yam LT. J Bone Miner Res. 2008. 23(8):1287-95.
3.Honig, A, Rieger L, Kapp M, Krockenberger M, Eck M, et al. BMC Cancer. 2006. 6:199.
4.Muniyan S, Chaturvedi NK, Dwyer JG, Lagrange CA, Chaney WG, et al. Int J Mol Sci. 2013. 14(5):10438-64.
5.Scerra G, De Pasquale V, Scarcella M, Caporaso MG, Pavone LM, et al. Open Biol. 2022. 12(10):220155.
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