碧云天研发的Amplex Red ADP检测试剂盒(Amplex Red ADP Assay Kit)是一种基于探针Amplex Red，利用荧光或吸光度检测，快速、高灵敏地对血清、血浆、尿液等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清样品中ADP含量进行检测的试剂盒。通常0.5-5µl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的荧光法检测。

二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate, ADP)，即腺苷的5′-焦磷酸酯，是由一个腺苷与两个相连的磷酸根组成的化合物，分子式为C10H15N5O10P2，分子量为427.2。ADP是一种核苷酸，在能量转移反应中起着关键作用。在生物体内，ADP通常为三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)水解失去一个磷酸根，即断裂一个高能磷酸键，并释放能量后的产物；同时，ADP具有一个高能磷酸键，通过腺苷酸激酶能可逆地转变为ATP。在ATP与ADP之间的转化过程中，多种磷酸(酯)酶、磷酸化酶(激酶)均参与其中。血小板中储存着ADP，当血小板发生凝聚反应时，储存于血小板致密颗粒内的ADP被释放出来，并作用于各种嘌呤受体，从而介导细胞内信号传导及血小板聚集过程。ADP的水平调控着多种参与中间代谢的酶分子活性[1,2]。

本试剂盒中的Amplex Red是一种对H2O2高度敏感的荧光探针。在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情况下，Amplex Red能与H2O2 1:1反应，产生强烈的红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。试卤灵的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收。因此本试剂盒可以用吸光度和荧光两种方法来进行检测。

本试剂盒的检测原理请参考图1。在丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)的催化作用下ADP与磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)反应产生丙酮酸(Pyruvic acid)和ATP。在黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)、硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate, TPP)和镁离子存在的条件下，生成的丙酮酸进一步在丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase, PO)的作用下和氧气发生氧化反应生成乙酰磷酸(Acetyl phosphate)和H2O2，再通过检测H2O2与Amplex Red的反应产物试卤灵(Resorufin)的荧光强度或吸光度来最终计算样品中ADP的含量。试卤灵的荧光强度或吸光度与样品中ADP的含量成正比。

图1.碧云天Amplex Red ADP检测试剂盒(S0307)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时，采用吸光度检测可以检测浓度低至10μM的ADP，在10-500μM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测可以检测浓度低至1μM的磷酸盐，在1-200μM浓度范围内有良好的线性关系。荧光检测的灵敏度比吸光度检测高约10倍，可以使用更少量的样品。本试剂盒提供了ADP标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，计算出样品中的ADP含量。

图2.碧云天Amplex Red ADP检测试剂盒(S0307)检测ADP标准品的标准曲线。左图为吸光度检测，右图为荧光检测。本试剂盒采用吸光度检测时，在10-500µM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在1-200µM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒检测方法灵活，检测速度快。本试剂盒既可以进行荧光检测，也可进行吸光度检测。整个检测过程约30分钟即可完成。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒应用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0307S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0307S-2	ADP Assay Buffer	20ml
S0307S-3	Amplex Red	200μl
S0307S-4	Enzyme Solution A	200μl
S0307S-5	Enzyme Solution B	200μl
S0307S-6	Cofactor	200μl
S0307S-7	ADP Standard (10mM)	200μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中Amplex Red和Cofactor须避光保存。

注意事项：

Amplex Red在空气中不太稳定，开启后应尽快使用，且在使用过程中需注意适当避光。

Amplex Red的反应产物在还原剂的存在下会很不稳定，因此最终反应体系中的二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇或类似还原剂的浓度应低于10µM。

请确保反应体系的pH值在7-8之间，否则会影响Amplex Red的稳定性和荧光值。

Amplex Red和ADP Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各种溶液使用时应在冰上进行。

为减少稀释液产生的荧光背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其它样品时，宜使用ADP Assay Buffer稀释。

血清、血浆等样品如果在4ºC保存，保存的时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解Amplex Red和ADP Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.Amplex Red反应工作液(Working Solution)的配制：按照每个反应80µl的体积配制适量的Amplex Red反应工作液。均匀混合72µl ADP Assay Buffer、2µl Amplex Red、2µl Enzyme Solution A、2µl Enzyme Solution B 、2µl Cofactor，即可配制成80µl Amplex Red反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的Amplex Red反应工作液。具体配制方法参考下表。配制好的Amplex Red反应工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
ADP Assay Buffer (µl)	72	720	1440	3600
Amplex Red (µl)	2	20	40	100
Enzyme Solution A (µl)	2	20	40	100
Enzyme Solution B (µl)	2	20	40	100
Cofactor (µl)	2	20	40	100
Working Solution (µl)	80	800	1600	4000

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：丙酮酸和H2O2的存在会对ADP的检测产生干扰。如果样品含有丙酮酸或者H2O2，须同时设置背景对照孔，加入不含Enzyme Solution A的Amplex Red反应工作液，即配制Amplex Red反应工作液时2µl Enzyme Solution A用ADP Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数需要减去对照孔的读数。
3.样品测定：
a.ADP标准曲线设置(吸光度或荧光检测，可选取其中的一种，对于样品量较少或浓度较低的情况，优先推荐采用荧光检测)。
(a)吸光度检测：取5μl ADP Standard (10mM)，加入95μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或者ADP Assay Buffer (如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等无需处理的样品，可以使用ADP Assay Buffer)，混匀，配制成浓度为500μM的ADP标准溶液。分别取500μM的ADP标准溶液0、4、8、12、16、20μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或ADP Assay Buffer补足至20μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、100、200、300、400、500μM。
注：吸光度检测时建议使用透明96孔板(FPT010/FPT011/FCP962)。
(b)荧光检测：取2μl ADP Standard (10mM)，加入98μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或者ADP Assay Buffer (如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等无需处理的样品，可以使用ADP Assay Buffer)混匀，配制成浓度为200µM的ADP标准溶液。分别取200μM的ADP标准溶液0、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或ADP Assay Buffer补足至20μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、10、20、50、100、200μM。
注：荧光检测时建议使用96孔黑板(FCP965/FCP966)。
b.取1-20μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或ADP Assay Buffer至样品孔中，补足至20µl。同时设置仅含BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或ADP Assay Buffer的孔为空白对照。
注：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中ADP的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，请使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，可以使用ADP Assay Buffer稀释。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=10×20/10=20)。
c.各孔加入Amplex Red反应工作液80µl，混匀，37ºC避光反应30分钟。
注：如果吸光度偏低或荧光偏弱，可适当延长反应时间，例如反应45或60分钟。
d.如果使用吸光度检测，测定A570；如果使用荧光检测，设置激发波长为560nm，发射波长为590nm进行荧光强度检测。
e.建立标准曲线，并计算样品中ADP的浓度(A)，如果样品的背景对照信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。ADP标准曲线可以参考图2，吸光度检测在10-500μM浓度范围内有良好的线性关系，荧光检测在1-200μM浓度范围内有良好的线性关系。ADP浓度的计算公式如下：
C (μM) = A × n
注：A为步骤3e根据标准曲线确定的ADP浓度(μM)；
n为步骤3b样品总稀释倍数。
参考文献：
1.Puri RN, Colman RW. Crit Rev Biochem Mol Biol. 1997. 32(6):437-502.
2.Gachet C. Ann Med. 2000. 32 Suppl 1:15-20.
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