碧云天研发的异柠檬酸检测试剂盒(WST-8法) (Isocitrate Assay Kit with WST-8)是一种基于WST-8显色反应，通过比色法，快速、高灵敏地对血清和血浆等生物体液、组织和细胞样品以及食品灯光样品中异柠檬酸与异柠檬酸盐含量进行检测的试剂盒。

异柠檬酸(Isocitric acid、Isocitrate)，又称1-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸，分子式为C6H8O7，分子量为192.12，是柠檬酸的异构体。异柠檬酸在许多水果和蔬菜及其加工产品中含量较高，常用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。在工业上，异柠檬酸被用作鉴定水果汁的质量和纯度的指标。

异柠檬酸作为三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)过程中的代谢物之一，由柠檬酸在乌头酸酶的作用下可逆地生成。异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase, IDH)的作用下氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate, α-KG)，在异柠檬酸裂合酶(Isocitrate lyase)的作用下生成琥珀酸与乙醛酸。异柠檬酸在生物体内参与机体代谢、组织结构形成和酶活性代谢等一系列生化反应[1]。总之，异柠檬酸在生物的生命机体内发挥着重要作用。

本试剂盒的检测原理如图1所示。异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase)的作用下氧化生成α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate, α-KG)，在这一反应过程中NAD+或NADP+被还原为NADH或NADPH；生成的NADH或NADPH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的Formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的Formazan与样品中异柠檬酸的含量成正比。

图1.碧云天异柠檬酸检测试剂盒(WST-8法) (S0523)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时可以检测浓度低至50μM的异柠檬酸，在50μM-20mM (1-400nmol)浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了异柠檬酸标准溶液，可以通过设置标准曲线(图2)，从而计算出样品中的异柠檬酸含量。

图2.碧云天异柠檬酸检测试剂盒(WST-8法) (S0523)检测异柠檬酸标准品的标准曲线。本试剂盒测定异柠檬酸标准品时，在50μM-20mM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；，而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品及果汁、食品等的检测，全程约0.5-1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0523S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0523S-2	异柠檬酸检测缓冲液	20ml
S0523S-3	酶溶液	200μl
S0523S-4	显色液	200μl
S0523S-5	底物	200μl
S0523S-6	异柠檬酸标准溶液(100mM)	200μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中显色液、底物和异柠檬酸标准溶液(100mM)须避光保存。

注意事项：

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、异柠檬酸检测缓冲液(后续简称检测缓冲液)、显色液和底物需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。酶溶液和异柠檬酸标准溶液使用时应在冰上进行。

底物从-20ºC拿出在融解过程中可能会有析出，平衡至室温后析出的部分会复溶，不会对检测结果产生影响。

血清等样品如在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

为减少稀释液产生的背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其它样品时，应使用检测缓冲液稀释。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、检测缓冲液、显色液和底物，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.显色工作液(Working Solution)的配制：按照每个检测反应80μl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合74μl检测缓冲液(Isocitrate Assay Buffer)、2μl酶溶液(Enzyme Solution)、2μl显色液(Chromogen Solution)、2μl底物(Substrate)，即可配制成80μl显色工作液(Working Solution)。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Isocitrate Assay Buffer (μl)	74	740	1480	3700
Enzyme Solution (μl)	2	20	40	100
Chromogen Solution (μl)	2	20	40	100
Substrate (μl)	2	20	40	100
Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：NADH和NADPH的存在会对异柠檬酸的检测产生干扰。如果样品含有NADH或NADPH，需同时设置样品背景对照孔，加入不含酶溶液的显色工作液，即配制显色工作液时2µl酶溶液用检测缓冲液替代。计算时样品孔的数据时需要减去样品背景对照孔的数据。
3.样品测定：
a.异柠檬酸标准曲线的设置：取20μl异柠檬酸标准溶液(100mM)，加入80μl检测裂解液或检测缓冲液(如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果是血液、上清等无需处理的样品，使用检测缓冲液)，混匀，即得浓度为20mM的异柠檬酸标准溶液。分别取20mM的异柠檬酸标准溶液0、0.5、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用对应的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或检测缓冲液补足到20μl，此时标准曲线的浓度为0、0.5、1、2、5、10、20mM。
b.加入1-20μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入检测裂解液或检测缓冲液至样品孔中，补足到20µl。同时设置仅含检测裂解液或检测缓冲液的孔为空白对照孔。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数，以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者增加样品的用量。如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，使用检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的稀释；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，使用检测缓冲液稀释。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=10×20/10=20)。
c.各孔加入显色工作液80μl，混匀，37ºC反应30分钟。
注：如果吸光度偏低，可适当延长反应时间。
d.在450nm测定吸光度。
e.建立标准曲线，并计算样品中异柠檬酸的浓度(记录为A)，如果样品背景对照孔吸光度比较高，样品的吸光度需要减去样品背景对照孔的吸光度。异柠檬酸标准曲线可以参考图2，在50μM-20mM浓度范围内有良好的线性关系。异柠檬酸浓度的计算公式如下：
C (mM) = A × n
注1：A为步骤3e根据标准曲线确定的稀释后的样品异柠檬酸浓度(mM)；
n为步骤3b样品总稀释倍数。
注2：计算获得的异柠檬酸浓度其中包含了异柠檬酸和异柠檬酸根的摩尔浓度，也可以理解为包含了异柠檬酸和异柠檬酸盐的摩尔浓度。上述仅为了表述方便，仅描述为异柠檬酸。如有必要，可根据异柠檬酸的分子量192.12计算出样品中异柠檬酸的质量浓度(μg/ml) = C × 0.19212。
参考文献：
1.LaPorte DC. J Cell Biochem. 1993. 51(1):14-18.
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