碧云天研发的L-苹果酸检测试剂盒(WST-8法) (L-Malate Assay Kit with WST-8)是一种基于WST-8的显色反应，通过比色法，快速、高灵敏地对组织或细胞样品、血清和血浆等生物体液以及饮料和果汁等样品中L-苹果酸与L-苹果酸盐含量进行检测的试剂盒。

苹果酸(Malate, Malic acid)，又称2-羟基丁二酸，分子式为C4H6O5，分子量为134.09。苹果酸是一种生物体生成的二羧酸，是人体必需的一种有机酸。苹果酸有L-苹果酸和D-苹果酸2种异构体，天然存在的苹果酸几乎都是L型的。L-苹果酸是天然果汁的重要成份，口感接近天然苹果的酸味，与柠檬酸相比，口感更好，产生的热量更低，被誉为“最理想的食品酸味剂”，是目前世界食品工业中用量巨大和发展前景较好的有机酸之一[1-2]。苹果酸是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、化妆品、医疗和保健品等领域，已成为继柠檬酸、乳酸之后用量排第三位的食品酸味剂，对苹果酸进行定量测定了解相关状况以及对相关食品的生产等具有重要意义[1-2]。

苹果酸作为三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)的重要中间体，在代谢过程中起着重要作用。在植物的C4固定过程中，苹果酸是卡尔文循环中CO2的来源。在低等生物中，苹果酸在苹果酸-乳酸发酵过程中通过二氧化碳的形成转化为乳酸。苹果酸也可以通过植物叶片保卫细胞中磷酸烯醇式丙酮酸的羧化作用合成的。苹果酸作为一种双阴离子，在溶质被吸收到保卫细胞的过程中经常伴随着钾阳离子，以维持细胞内的电位平衡。这些溶质在保卫细胞内的积累降低了溶质电位，使水进入细胞并促进气孔的开口[3]。

本试剂盒的检测原理请参考图1。L-苹果酸在苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase, MDH)的作用下氧化生成草酰乙酸(Oxalacetic acid, OAA)，在这一反应过程中NAD+被还原为NADH；生成的NADH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的Formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的Formazan与样品中L-苹果酸的含量成正比。

图1.碧云天L-苹果酸检测试剂盒(WST-8法) (S0511)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒能特异性检测L-苹果酸，而不检测D-苹果酸，在样品体积为20µl时可以检测浓度低达20μM的苹果酸，在20-500μM (0.4-10nmol)浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了苹果酸标准溶液，可以通过设置标准曲线(图2)，从而计算出样品中的L-苹果酸含量。

图2.碧云天L-苹果酸检测试剂盒(WST-8法) (S0511)检测苹果酸标准品的标准曲线。本试剂盒测定L-苹果酸标准品，在20-500μM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品以及饮料和果汁等样品的检测，全程约0.5-1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0511S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0511S-2	苹果酸检测缓冲液	20ml
S0511S-3	酶溶液	200μl
S0511S-4	显色液	200μl
S0511S-5	底物	200μl
S0511S-6	苹果酸标准溶液(10mM)	100μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中显色液和底物须避光保存。

注意事项：

本试剂盒仅能检测L-苹果酸或L-苹果酸盐，不能检测D-苹果酸或D-苹果酸盐。

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、苹果酸检测缓冲液(后续简称检测缓冲液)、显色液和底物需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。酶溶液和苹果酸标准溶液使用时应在冰上进行。

底物从-20ºC拿出在融解过程中可能会有析出，平衡至室温后析出的部分会复溶，不会对检测结果产生影响。

血清等样品如在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

为减少稀释液产生的背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其它样品时，宜使用检测缓冲液稀释。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、检测缓冲液、显色液和底物，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.显色工作液(Working Solution)的配制：按照每个检测反应80μl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合74μl检测缓冲液(Malate Assay Buffer)、2μl酶溶液(Enzyme Solution)、2μl显色液(Chromogen Solution)、2μl底物(Substrate)，即可配制成80μl显色工作液(Working Solution)。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Malate Assay Buffer (μl)	74	740	1480	3700
Enzyme Solution (μl)	2	20	40	100
Chromogen Solution (μl)	2	20	40	100
Substrate (μl)	2	20	40	100
Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：当样品有背景会对检测产生干扰时，需同时设置样品背景对照孔，加入不含酶溶液的显色工作液，即配制显色工作液时2µl酶溶液用检测缓冲液替代。计算时样品孔的读数需要减去样品背景对照孔的读数。
3.样品测定：
a.苹果酸标准曲线设置：取25μl苹果酸标准溶液(10mM)，加入475μl检测裂解液或检测缓冲液(如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，使用检测缓冲液)，混匀，配制成浓度为500μM的苹果酸标准溶液。分别取500μM的苹果酸标准溶液0、1、2、4、8、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用对应的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或检测缓冲液补足到20μl，此时标准曲线的浓度为0、25、50、100、200、500μM。
b.加入1-20μl样品或稀释后的样品到96孔板样品孔中，并相应地再加入检测裂解液或检测缓冲液至样品孔中，补足到20µl。同时设置仅含裂解液或检测缓冲液的孔为空白对照孔。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数，以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者增加样品的量。如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释样品；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，使用检测缓冲液稀释。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=10×20/10=20)。
c.各孔加入显色工作液80μl，混匀，37ºC反应30分钟。
注：如果吸光度偏低，可适当延长反应时间，例如反应45或60分钟。
d.在450nm测定吸光度。
e.建立标准曲线，并计算样品中L-苹果酸的浓度(记录为A)，如果样品背景对照孔吸光度比较高，样品的吸光度需要减去样品背景对照的吸光度。L-苹果酸标准曲线可以参考图2，在20-500μM浓度范围内有良好的线性关系。L-苹果酸浓度的计算公式如下：
C (μM) = A × n
注1：A为步骤3e根据标准曲线确定的稀释后的样品L-苹果酸浓度(μM)；
n为步骤3b样品总稀释倍数；
注2：计算获得的L-苹果酸浓度其中包含了L-苹果酸和L-苹果酸根的摩尔浓度，也可以理解为包含了L-苹果酸和L-苹果酸盐的摩尔浓度。上述仅为了表述方便，仅描述为L-苹果酸。如有必要，可根据L-苹果酸的分子量134.09计算出样品中L-苹果酸的质量浓度(μg/ml) = C × 0.13409
参考文献：
1.Duarte A M, Caixeirinho D, Miguel M G, et al. Acta Horticulturae. 2010. 933: 601-606.
2.Jensen W B. Journal of Chemical Education. 2007. 84(6): 924.
3.Takeya M, Ito S, Sukigara H, Osanai T. Front Plant Sci. 2018.13(9):947.
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