碧云天研发的琥珀酸脱氢酶活性检测试剂盒(显色法) (Succinate Dehydrogenase Activity Assay Kit, Colorimetric)，简称SDH检测试剂盒(Succinate Dehydrogenase Assay Kit or SDH Assay Kit)，是一种用比色法，快速、高灵敏地对组织、细胞或分离的线粒体中琥珀酸脱氢酶活性进行检测的试剂盒。

本试剂盒与Merck (Sigma-Aldrich)公司的Succinate Dehydrogenase Activity Colorimetric Assay Kit (MAK197)检测原理和检测方法基本一致。

琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase, SDH)，也称琥珀酸-辅酶Q还原酶(Succinate-coenzyme Q reductase, SQR)、呼吸链复合体II (Respiratory complex II)，是位于线粒体内膜上的一种多亚基膜结合酶，属于黄酶素类的细胞色素氧化酶。SDH由2个亲水性亚基和2个疏水性膜锚定亚基组成，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子。SDH可催化琥珀酸氧化为延胡索酸(Fumarate)，并将电子直接从FADH2传递至辅酶Q (Coenzyme Q, CoQ)，通过三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TAC)和电子传递链来维持细胞的能量代谢。因此，SDH是反应线粒体活性的标志酶之一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。SDH的突变可导致遗传性副神经节瘤/嗜铬细胞瘤综合征和一种被称为利氏综合征的神经退行性疾病[1-3]，因此检测SDH对于临床相关疾病的诊断、预防和治疗等具有重要意义。

本试剂盒的检测原理如图1所示。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸(Succinate)脱氢生成延胡索酸，通过人工电子受体吩嗪二甲酯硫酸盐(5-Methylphenazinium methosulfate, PMS)递氢将蓝色的2,6-二氯靛酚钠(2,6-Dichloroindophenol sodium salt hydrate, DCIP)还原，DCIP在600nm处具有特征吸收峰，通过吸光度的变化即可测定DCIP的还原速度，进而间接反映琥珀酸脱氢酶的活性。样品中琥珀酸脱氢酶的活性越高，被还原的DCIP则越多，剩余的蓝色的DCIP就越少，琥珀酸脱氢酶的活性与反应体系中残留的DCIP成反比。

图1.碧云天琥珀酸脱氢酶活性检测试剂盒(显色法) (S0530)检测原理示意图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为50µl时可以检测活力浓度低至0.6U/L的琥珀酸脱氢酶，在0.67-66.7U/L活力范围内有良好的线性关系。本试剂盒内提供了标准品DCIP (100mM)，可以通过设置标准曲线(图2)，从而间接计算出样品中琥珀酸脱氢酶的活性。

图2.碧云天琥珀酸脱氢酶活性检测试剂盒(显色法) (S0530)对DCIP标准品和小鼠不同组织样品的检测效果。左图为本试剂盒对标准品DCIP的检测效果，在0-100nmol范围内有良好的线性关系；右图为80μg小鼠肌肉样品和90μg小鼠肝脏样品使用本试剂盒在反应30分钟内的信号变化图。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆等生物体液、细胞培养上清以及组织、细胞或线粒体等样品的检测，全程约1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0530S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	25ml
S0530S-2	SDH Assay Buffer	20ml
S0530S-3	DCIP (100mM)	100μl
S0530S-4	SDH Substrate	120μl
S0530S-5	SDH Probe	100μl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中DCIP (100mM)、SDH Probe须-20ºC避光保存。

注意事项：

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay和SDH Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。DCIP (100mM)冻融可能会有析出、且易沉降，使用前须37ºC水浴约5分钟，并充分混匀后再使用。其它试剂在使用时应在冰上进行。

血清等样品如果在4ºC保存，保存时间不得超过1周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备。
a.血液样品的准备。对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要触及白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备。对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备。对于贴壁细胞，直接取培养液上清；对于悬浮细胞，离心取培养液上清。
d.线粒体样品准备。建议从新鲜组织和细胞中分离线粒体。推荐使用碧云天细胞线粒体分离试剂盒(C3601)和组织线粒体分离试剂盒(C3606)。
2.试剂盒的准备。
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay和SDH Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。DCIP (100mM) 37ºC水浴约5分钟，使其充分融解。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.SDH检测工作液的配制：按照每个检测需要50µl SDH检测工作液的体积配制适量的SDH检测工作液。均匀混合47.5µl SDH Assay Buffer、1µl SDH Substrate、0.5µl DCIP (100mM)、1µl SDH Probe，即可配制成50µl SDH检测工作液(SDH Assay Working Solution)。根据待检测样品的数量，配制适量的SDH检测工作液。具体配制方法参考下表。配制好的SDH检测工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Sample Number	1	10	20
SDH Assay Buffer (µl)	47.5	475	950
DCIP (100mM) (μl)	0.5	5	10
SDH Substrate (μl)	1	10	20
SDH Probe (μl)	1	10	20
SDH Assay Working Solution (μl)	50	500	1000

注1：由于DCIP (100mM)和SDH Probe的用量较少且易沉降，特别是DCIP (100mM)，在使用前务必先轻轻涡旋再离心一下，并充分混匀后再使用。
注2：与电子供体PMS发生氧化还原反应的物质的存在会对琥珀酸脱氢酶的检测产生干扰，此时须同时设置背景对照孔，加入不含SDH Substrate的SDH检测工作液，即配制SDH检测工作液时1µl SDH Substrate用SDH Assay Buffer替代。更加理想的方式是把样品通过脱盐柱进行脱盐处理，去除其中可能干扰检测的代谢小分子，这样仅使用试剂盒提供的SDH底物，就能更准确地检测出样品中的SDH酶活性了。脱盐柱推荐使用BeyoDesalt™ G-25 Spin脱盐柱(P2613)。
3.DCIP标准曲线的设置。
取4μl DCIP (100mM)，加入196μl SDH Assay Buffer，混匀，配制成200μl浓度为2mM的DCIP标准溶液，再分别取0、0.5、1、2.5、5、10、20、30、40、50μl的2mM DCIP标准溶液加入96孔板的标准品孔中，并用SDH Assay Buffer补足至50μl，此时，DCIP标准曲线的各孔DCIP浓度和物质的量分别为0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2mM和0、1、2、5、10、20、40、60、80、100nmol。
4.样品测定。
a.取1-50μl步骤1制备的样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应的加入SDH Assay Buffer至样品孔中，补足至50µl。同时设置仅含SDH Assay Buffer的孔为空白对照孔。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中琥珀酸脱氢酶的的大致活性。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者样品的量。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为25µl，则n=10×50/25=20)。
b.样品孔各孔加入50μl SDH检测工作液，标准品孔各孔加入50μl SDH Assay Buffer，混匀。
c.立即使用适当的酶标仪测定A600，此时记录为0分钟读值为A1。
d.25ºC反应10-30分钟，反应时间记录为T，测定A600，记为A2。信号的变化值取决于琥珀酸脱氢酶催化消耗的DCIP的量，即∆A = A1 - A2。
注：为取得最佳的检测结果，反应时间可以根据待测样品中琥珀酸脱氢酶的活性进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于琥珀酸脱氢酶活性较高的样品，建议测定总时间为20分钟或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟；对于琥珀酸脱氢酶活性较低的样品，可以延长测定总时长为1小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟。也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取呈线性的时间点前的数据用于分析和计算。
5.计算。
a.标准品和样品的吸光度均需减去空白对照孔吸光度以纠正背景值。
b.建立DCIP标准曲线。将∆A值代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中琥珀酸脱氢酶催化消耗的DCIP量，记为Sa。如果样品背景对照孔信号比较高，样品的信号值需要减去样品背景对照值。由DCIP标准曲线(图2)可知，在0-100nmol范围内有良好的线性关系。
c.SDH活性的计算公式如下：SDH Activity (nmol/min/μl或mU/μl或U/ml) = Sa × n / (∆T × Sv )。
注：Sa为步骤5b中根据标准曲线确定的DCIP的减少量(nmol)；
n为步骤4a中样品总稀释倍数；
∆T为步骤4d中的反应时间(min)；
Sv为步骤4a中的样品孔总体积(Sv=50μl)；
琥珀酸脱氢酶活力单位的定义：一个酶活力单位(unit, U)在25ºC、pH7.2的条件下，1分钟内可以催化1.0μmol DCIP。
计算示例：
Sa=26.28nmol (根据∆A值和标准曲线计算所得)，n=1
∆T=30min
Sv=50μl
SDH Activity (nmol/min/μl or mU/μl)=26.28nmol / (30min×50μl) = 0.0175
参考文献：
1.Kim HJ, Winge DR. Biochim. Biophys. Acta, 2013. 1827(5):627-636.
2.Rutter J, Winge DR, Schiffman JD. Mitochondrion. 2010. 10(4):393-401.
3.Bardella C, Pollard PJ, Tomlinson I. Biochim Biophys Acta. 2011. 1807(11):1432-1443.
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