碧云天研发的Amplex Red肌酸激酶检测试剂盒(Amplex Red Creatine Kinase Assay Kit, 简称Amplex Red CK Assay Kit)是一种基于探针Amplex Red，利用荧光或吸光度检测，快速、高灵敏地对血清、血浆等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清样品中肌酸激酶活性进行检测的试剂盒。通常0.2-2µl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的荧光法检测。

肌酸激酶(Creatine kinase, CK)，也称肌酸磷酸激酶(Creatine phosphokinase, CPK)或磷酸肌酸激酶，主要存在于心肌、骨骼肌和脑组织中，能可逆地催化肌酸与三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)之间的转磷酰基反应，在能量运转、肌肉收缩和ATP再生中有重要作用。肌酸激酶由B (脑型)和M (肌肉型)两个亚基组成，有三种不同的同工酶：CK-MM (骨骼肌)、CK-BB (大脑)和CK-MB (心肌)。其同工酶具有相同的分子量，但分子结构和来源不同。骨骼肌表达高水平的CK-MM (98%)和低水平的CK-MB (1%)，心肌表达CK-MM (70%)和CK-MB (25-30%)，CK-BB主要在脑和平滑肌中表达，包括血管和子宫组织[1]。

正常情况下，肌酸激酶主要存在于肌细胞内，如果血液中检测到肌酸激酶升高，提示有肌肉损伤。CK水平升高与许多疾病有关，临床上肌酸激酶在血液检查中作为富含CK的组织损伤的标志物进行测定，例如心肌梗塞、横纹肌溶解症、肌营养不良症、自身免疫肌肉、急性肾损伤、肺梗塞和脑瘤等。血清CK测定主要用于骨骼肌疾病及心肌损伤相关疾病的诊断，此外，同工酶测定已被广泛用作心脏病发作中心肌损伤的指征[2]。因此，CK的准确测定对于疾病的早期诊断、预测和治疗至关重要。

本试剂盒中的Amplex Red是一种对H2O2高度敏感的荧光探针。在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情况下，Amplex Red能与H2O2 1:1反应，产生强烈的红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。试卤灵的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收。因此本试剂盒可以用吸光度和荧光两种方法来进行检测。

本试剂盒的检测原理请参考图1。肌酸激酶(Creatine kinase, CK)首先催化肌酸(Creatine)和ATP反应生成磷酸肌酸(Phosphocreatine, PCr)和二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate, ADP)，生成的ADP再在丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)的作用下与磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)反应产生丙酮酸(Pyruvic acid)和ATP。在黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)、硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate, TPP)和镁离子的存在下，生成的丙酮酸进一步在丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase, PO)的作用下和氧气发生氧化反应生成乙酰磷酸(Acetyl phosphate)、CO2和H2O2，再通过检测H2O2与Amplex Red的反应产物试卤灵(Resorufin)的荧光强度或吸光度来最终计算样品中肌酸激酶的酶活力。试卤灵的荧光强度或吸光度与样品中肌酸激酶的活力成正比。

图1.碧云天Amplex Red肌酸激酶检测试剂盒(S0287)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时，采用吸光度检测可以检测活力低至0.67mU/ml的肌酸激酶，在0.67-16.7mU/ml活力范围内有良好的线性关系；采用荧光检测可以检测浓度低至0.067mU/ml的肌酸激酶，在0.067-6.67mU/ml活力范围内有良好的线性关系。荧光检测的灵敏度比吸光度检测高约10倍，可以使用更少量的样品。本试剂盒提供了肌酸激酶作用产物ADP的标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，间接计算出样品中的肌酸激酶活力。

图2.碧云天Amplex Red肌酸激酶检测试剂盒(S0287)检测ADP标准品的标准曲线。左图为吸光度检测，右图为荧光检测。本试剂盒采用吸光度检测时，在0.67-16.7mU/ml活力范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在0.067-6.67mU/ml活力范围内有良好的线性关系。肌酸激酶1个酶活力单位(unit, U)在37ºC条件下，在1分钟内可以生成1µmol ADP。注：相关的肌酸激酶活性通过ADP标准曲线间接计算得出。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒检测方法灵活，检测速度快。本试剂盒既可以进行荧光检测，也可进行吸光度检测。整个检测过程约1小时即可完成。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒应用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0287S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0287S-2	CK Assay Buffer	20ml
S0287S-3	Amplex Red	200μl
S0287S-4	Enzyme Mix	200μl
S0287S-5	Cofactor	200μl
S0287S-6	CK Substrate	200μl
S0287S-7	ADP Standard (10mM)	100μl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中Amplex Red和Cofactor须避光保存。

注意事项：

Amplex Red在空气中不太稳定，开启后应尽快使用，且在使用过程中需注意适当避光。

Amplex Red的反应产物在还原剂的存在下会很不稳定，因此最终反应体系中的二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇或类似还原剂的浓度应低于10μM。

请确保反应体系的pH值在7-8之间，否则会影响Amplex Red的稳定性和荧光值。

Amplex Red和CK Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各种溶液使用时应在冰上进行。

为减少稀释液产生的荧光背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其它样品时，宜使用CK Assay Buffer稀释。

血清、血浆等样品如果在4ºC保存，保存的时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解Amplex Red和CK Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.Amplex Red反应工作液(Working Solution)的配制：按照每个反应80μl的体积配制适量的Amplex Red反应工作液。均匀混合72µl CK Assay Buffer、2µl Amplex Red、2µl Enzyme Mix、2µl Cofactor、2µl CK Substrate，即可配制成80µl Amplex Red反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的Amplex Red反应工作液。具体配制方法可以参考下表。配制好的Amplex Red反应工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
CK Assay Buffer (µl)	72	720	1440	3600
Amplex Red (µl)	2	20	40	100
Enzyme Mix (µl)	2	20	40	100
Cofactor (µl)	2	20	40	100
CK Substrate (µl)	2	20	40	100
Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：ADP、丙酮酸等的存在会对肌酸激酶的检测产生干扰。如果样品含有ADP、丙酮酸或过氧化氢，需同时设置样品背景对照孔，加入不含CK Substrate的Amplex Red反应工作液，即配制Amplex Red反应工作液时2µl CK Substrate用CK Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数需要减去背景对照孔的读数。
3.样品测定：
a.ADP标准曲线设置(吸光度或荧光检测，可选取其中的一种，对于样品量较少或浓度较低的情况，优先推荐采用荧光检测)
(a)吸光度检测：取5µl ADP Standard (10mM)，加入95μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或者CK Assay Buffer (如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等无需处理的样品，可以使用CK Assay Buffer)，混匀，配制成浓度为500μM的ADP标准溶液。分别取500μM的ADP标准溶液0、4、8、12、16、20μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或CK Assay Buffer补足至20μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、100、200、300、400、500μM。
注：吸光度检测时建议使用透明96孔板(FPT010/FPT011/FCP962)。
(b)荧光检测：取2µl ADP Standard (10mM)，加入98μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或者CK Assay Buffer (如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等无需处理的样品，可以使用CK Assay Buffer)混匀，配制成浓度为200μM的ADP标准溶液。分别取200μM的ADP标准溶液0、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或CK Assay Buffer补足至20μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、10、20、50、100、200μM。
注：荧光检测时建议使用96孔黑板(FCP965/FCP966)。
b.取1-20μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或CK Assay Buffer至样品孔中，补足至20µl。同时设置仅含BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或CK Assay Buffer的孔为空白对照。
注：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中肌酸激酶的大致活力，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，请使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，可以使用CK Assay Buffer稀释。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=10×20/10=20)。
c.各孔加入Amplex Red反应工作液80µl，混匀，37ºC避光反应T1分钟(如2-3分钟)。如果使用吸光度检测，测定A570，记为A1；如果使用荧光检测，设置激发波长为560nm，发射波长为590nm进行荧光强度检测，记为RFU1。
d.继续37ºC避光反应T2分钟(如25-30分钟)，测定A570，记为A2，或者设置激发波长为560nm，发射波长为590nm进行荧光强度检测，记为RFU2。信号的增强取决于CK催化产生的ADP的量，ΔA = A2 – A1，ΔRFU = RFU2 – RFU1。
注：如果吸光度偏低或荧光偏弱，可适当延长反应时间，例如反应45或60分钟。
e.建立标准曲线，将ΔA或ΔRFU带入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中肌酸激酶催化产生的ADP浓度(B)，如果样品的背景对照信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。ADP标准曲线可以参考图2，吸光度检测在20-500μM浓度范围内有良好的线性关系，荧光检测在2-200μM浓度范围内有良好的线性关系。CK酶活力的计算公式如下：
CK (mU/ml) = B × n / (T2 - T1)
注：B为步骤3e根据标准曲线确定的ADP浓度(μM)；
n为步骤3b样品总稀释倍数；
T1为步骤3c的反应时间，T2为步骤3d的反应时间。
肌酸激酶活力单位的定义：1个酶活力单位(unit, U)在37ºC条件下，在1分钟内可以生成1µmol ADP。
参考文献：
1.Shoji S. Nihon Rinsho. 53(5):1136-40. Japanese.
2.Roberts R, Sobel BE. Am Heart J. 1978. 95(4):521-8.
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