Amplex Red黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选试剂盒
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产品编号 S0113S
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¥ 658.00
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碧云天研发的Amplex Red黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选试剂盒,即Amplex Red Xanthine Oxidase Inhibitor Screening Kit,也称Amplex Red XO Inhibitor Screening Kit或Amplex Red XOD Inhibitor Screening Kit,是一种基于探针Amplex Red利用荧光检测,简单、快速、灵敏地用于黄嘌呤氧化酶抑制剂高通量筛选的试剂盒。

黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase, XO or XOD)是体内核酸代谢中的一种重要酶,可以催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤,并能进一步催化黄嘌呤氧化为尿酸,同时产生过氧化氢以及超氧化物阴离子的一系列氧化反应,在包括人类在内的一些物种中的嘌呤分解代谢中起着重要作用[1]。在人类及其它灵长类动物中,XO通常存在于血清、肺、肝脏和肠黏膜中。在啮齿类动物中,XO在大部分组织中均有表达。血液中XO的活性通常都很低。当感染甲型流感时,血清及肺部的XO活性会增加[2]。当肝功能受损时,XO会大量释放到血液中,因此检测血液中XO水平被作为一个评估严重肝损伤(例如黄疸)的灵敏指标[3]。XO也可能与痛风的发病机理相关,黄嘌呤氧化酶是尿酸形成的代谢途径,因此使用黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇用于治疗痛风。此外,研究显示抑制XO活性可缓解心血管疾病及慢性阻塞性肺疾病[4,5]。

本试剂盒的检测原理请参考图1。黄嘌呤(Xanthine)在黄嘌呤氧化酶的催化作用下和氧气发生氧化反应生成尿酸(Uric acid)和H2O2。本试剂盒提供的XO Probe是一种对H2O2高度敏感的荧光探针,在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情况下,XO Probe能与H2O2 1:1反应,产生强烈的红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。试卤灵的最大激发波长为571nm,最大发射波长为585nm,荧光强度与黄嘌呤氧化酶催化产生的H2O2的量成正比。如果在反应中加入黄嘌呤氧化酶抑制剂(Inhibitor),黄嘌呤氧化酶的活性会被抑制,导致H2O2的生成量减少,进而抑制荧光的生成,荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比,这样就可以检测出抑制剂的抑制效果。

图1.碧云天Amplex Red黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选试剂盒(S0113)的原理图。

本试剂盒含抑制剂阳性对照,使用便捷。本试剂盒提供XO检测缓冲液(XO Assay Buffer)、黄嘌呤氧化酶(XO)、XO底物(XO Substrate)、阳性对照非布司他(Febuxostat)及可以催化产生荧光需要的探针(XO Probe)和辣根过氧化物酶(HRP)。阳性对照Febuxostat是一种选择性的非嘌呤类XO抑制剂,临床上常用于痛风及高尿酸血症的治疗。通常Febuxostat的IC50约为2nM-20nM。使用本试剂盒检测Febuxostat的效果请参考图2。

图2.碧云天Amplex Red黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选试剂盒(S0113)检测Febuxostat的效果图。图中Febuxostat的IC50约为5nm。实测结果可能会因样品和检测条件等的不同而存在差异,图中数据仅作参考。

本试剂盒检测速度快,检测灵敏度高。相较于黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选试剂盒(WST-8法) (S0111),本试剂盒在检测效率和灵敏度上有更进一步的提升,整个检测过程约15分钟即可完成。本试剂盒中XO和XO Substrate等的使用量进行了优化,不仅能检测出IC50很低的抑制剂,也能检测出IC50较高的抑制剂。

碧云天同时提供基于WST--8法的黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选试剂盒(S0111)。

按照使用说明操作,用于96孔板检测时,本试剂盒的小包装可以进行100次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
S0113S-1 XO Assay Buffer 30ml
S0113S-2 XO Probe 600μl
S0113S-3 XO (20X) 30μl
S0113S-4 HRP (20X) 30μl
S0113S-5 XO Substrate (10X) 60μl
S0113S-6 Febuxostat (10μM) 20μl
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。XO Probe和HRP须避光保存。

注意事项:

XO Probe在空气中不太稳定,开启后应尽快使用,且在使用过程中要注意适当避光。

XO Probe的反应产物在还原剂的存在下会很不稳定,样品中带入到最终反应体系中的二硫苏糖醇(DTT)或者β-巯基乙醇的浓度须低于10μM。

请确保样品的pH值在7-8之间,或者确保加入样品后反应体系的pH值在7-8之间,否则会影响XO Probe的稳定性和荧光值。

XO Assay Buffer和XO Probe需要完全解冻并平衡至室温后再使用,否则会影响检测结果。XO和HRP使用时应在冰上进行。使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒保存的条件进行保存。

待测抑制剂的溶剂可能会对检测产生干扰,推荐以XO Assay Buffer、Milli-Q级纯水(ST872)、DMSO (ST038)为溶剂配制、稀释待测抑制剂,并在对照孔中添加与抑制剂等体积的溶剂以排除干扰。如果使用其它溶剂请确保在最终的反应体系中溶剂浓度不应超过5%,如超过5%,请同时设置溶剂对照组以测试溶剂对酶活性的影响,排除干扰。

XO、HRP、XO Substrate等试剂的量均比较少,在使用前请先适当离心,然后适当混匀后再使用。

荧光检测时建议使用96孔黑板(FCP965/FCP966)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.样品的准备:
取适量待测定的抑制剂,用XO Assay Buffer、超纯水、DMSO等适当的溶剂配制成适宜浓度的溶液,如果有必要可以配制成适当的浓度梯度待用。
注1:抑制剂的稀释和配制建议使用同一种溶剂。
注2:XO Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用。
2.试剂盒的准备:
a.平衡除XO和HRP以外的其它所有试剂至室温,略离心使溶液沉淀至管底,再混匀备用。XO Probe、XO Substrate和Febuxostat可37ºC水浴0.5-2分钟促进融解。使用完毕后宜立即-20ºC保存。
b.XO (1X)的配制:按照每个样品需5μl XO (1X)配制适量的XO (1X)。取适量的XO (20X),按照1:19的比例加入XO Assay Buffer中。例如10μl XO (20X)加入190μl XO Assay Buffer,混匀即得200μl XO (1X)。配制好的XO (1X)可在冰浴上暂时保存,1小时内酶活性基本稳定。
注:所有涉及XO的操作应在冰上进行。
c.HRP (1X)的配制:按照每个样品需5μl HRP (1X)配制适量的HRP (1X)。取适量的HRP (20X),按照1: 19的比例加入XO Assay Buffer中。例如10μl HRP (20X)加入190μl XO Assay Buffer,混匀即得200μl HRP (1X)。配制好的HRP (1X) 4ºC或冰浴避光保存,当天可使用,但建议尽量现配现用。
d.XO Substrate (1X)的配制:按照每个检测需5μl XO Substrate (1X)配制适量的XO Substrate (1X)。取适量的XO Substrate (10X),按照1: 9的比例加入XO Assay Buffer中。例如10μl XO Substrate (10X)加入90μl XO Assay Buffer,混匀即得100μl XO Substrate (1X)。配制好的XO Substrate (1X) 4ºC或冰浴避光保存,当天可使用,但建议尽量现配现用。
e.Febuxostat溶液(Febuxostat Solution)的配制:本试剂盒提供的阳性对照抑制剂Febuxostat浓度为10μM,可以根据需要,使用与待测抑制剂一样的溶剂稀释至所需浓度或一系列浓度梯度。
3.样品测定:
a.参考下表,设置对照孔和样品孔,并按照下表依次加入样品和各溶液。加入待测样品后,混匀,37ºC孵育10分钟。
Blank Control 100% Activity Control Inhibitor Control Sample Group
XO Assay Buffer 80µl 75µl 75µl 75µl
XO (1X) - 5µl 5µl 5µl
Sample Solvent* 5µl 5µl - -
Febuxostat Solution - - 5µl -
Test Inhibitors - - - 5µl
37ºC, for 10 minutes
注1:* Sample Solvent(样品溶剂)是指配制和稀释待测抑制剂(Test Inhibitors)所用的溶剂。
注2:为获得更加可靠的检测结果,建议每个样品至少应该进行2个重复孔的检测。
b.每孔加入5μl HRP (1X)。
c.每孔加入5μl XO Probe。
d.每孔快速加入5μl XO Substrate (1X),混匀。
注:加入XO Substrate (1X)后反应即会开始,如果孔数较多,可以在低温下操作或使用排枪操作以减小各孔间加入XO Substrate (1X)的时间差而导致的误差,可以在培养板振荡器上进行混匀。
e.37ºC孵育5分钟后进行荧光测定。激发波长为560nm,发射波长为590nm。
注:当荧光读数偏低时,也可适当延长孵育时间至10-20分钟。
4.计算:
a.计算每个样品孔和对照孔的平均吸光度值,可分别记录为RFUBlank Control、RFU100% Activity Control、RFUInhibitor Control和RFUSample。
b.计算每个样品的抑制百分率。计算公式如下:
抑制率(%) = (RFU100% Activity Control – RFUSample)/( RFU100% Activity Control - RFUBlank Control) × 100%
c.对于检测发现有效的抑制剂,通过检测该抑制剂的剂量效应就可以测定出该抑制剂的IC50。使用本试剂盒检测Febuxostat对于XO的抑制作用的检测结果请参考图2。
参考文献:
1.Hille R, Hall J, Basu P. Chem Rev. 2014. 114(7):3963-4038.
2.Hemilä H. Br J Nutr. 1992. 67(1):3-16.
3.Battelli MG, Musiani S, Valgimigli M, Gramantieri L, Tomassoni F, et al. Am J Gastroenterol. 2001. 96(4):1194-1199.
4.Dawson J, Walters M. Br J Clin Pharmacol. 2006. 62(6):633-644.
5.Heunks LM, Viña J, van Herwaarden CL, Folgering HT, Gimeno A, et al. Am J Physiol. 1999. 277(6):1697-1704.
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