碧云天研发的D-乳酸检测试剂盒(WST-8法) (D-Lactate Assay Kit with WST-8)是一种基于WST-8的显色反应，通过比色法快速、高灵敏地对血清或血浆等生物体液、细胞或组织样品以及牛奶的发酵产品等食品中D-乳酸与D-乳酸盐含量进行检测的试剂盒。

乳酸(Lactic acid, LA)，是一种含有羟基的羧酸，化学名为2-羟基丙酸、α-羟基丙酸、丙醇酸，分子式为C3H6O3，分子量为90.08。根据其碳原子不对称性(即手性碳)，乳酸以右旋型D-乳酸(D(-)-Lactate)、左旋型L-乳酸(L(+)-Lactate)两种旋光异构体形式存在，两者等比例混合即为消旋的DL-乳酸。

L-乳酸由脑、红细胞、骨骼肌和肠产生，由肝脏、心脏和肾脏代谢，人体产生的乳酸几乎全部为L-乳酸。L-乳酸主要由肝脏从血液中清除，缺氧、酸中毒、供氧和低灌注会损害肝脏对L-乳酸的摄取，血液中的L-乳酸浓度对于重症监护和手术期间患者状况的诊断至关重要。高浓度的L-乳酸能指示肠梗塞、心脏骤停和败血症等疾病，唾液中L-乳酸浓度可作为囊性纤维化的早期诊断指标，L-乳酸也是能量代谢、脑和肿瘤细胞的生物标志物。在食品领域，L-乳酸在发酵过程中被用作质量、新鲜度、风味、稳定性、储存寿命的指示剂[1]。

D-乳酸主要来源于胃肠道细菌和外源性摄入，在组织中的产生量非常低，由于甲基乙二醛(Methylglyoxal, MGO)代谢作用，一般以纳摩尔浓度存在于哺乳动物的血液中[2]，在食品领域，D-乳酸可由乳酸菌产生，存在于许多乳制品饮料和腌制品中，比如酸奶、腌菜、腌肉等。在一些胃肠道疾病中，细菌D-乳酸的产生和从肠道进入血液的吸收会增加，进而导致肠道屏障受损引发炎症[3]。体内D-乳酸的过度积累可能导致潜在的危及生命的D-乳酸酸中毒(D-lactic acidosis or D-lactate encephalopathy)。D-乳酸酸中毒是一种罕见的神经系统综合征，主要发生在短肠综合征患者或空肠-回肠旁路手术后。症状通常出现在摄入高碳水化合物后，吸收不良的碳水化合物由结肠中的异常菌群发酵产生过量的D-乳酸[4]。因此，D-乳酸含量的测定对于监测细菌感染、短肠综合征、败血症等疾病具有重要生理学意义，或可作为肠道屏障完整性的标志[5]。

本试剂盒的检测原理如图1所示。D-乳酸在D-乳酸脱氢酶(D-Lactate dehydrogenase, D-LDH)的作用下氧化生成丙酮酸(Pyruvate)，在这一过程中NAD+还原为NADH；生成的NADH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)的作用下将WST-8还原成橙黄色的Formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的Formazan与样品中D-乳酸含量呈正比。

图1.碧云天D-乳酸检测试剂盒(WST-8法) (S0204)的检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒能特异性检测D-乳酸，而不检测L-乳酸，在样品体积为50μl时可检测含量低至20µM的D-乳酸，在0.02mM-1mM (1nmol-50nmol)浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了D-乳酸标准溶液，可以通过设置标准曲线(图2)，从而计算出样品中的D-乳酸含量。

图2.碧云天D-乳酸检测试剂盒(WST-8法) (S0204)检测D-乳酸标准品的标准曲线。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒检测使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品以及牛奶和发酵产品等食品的检测，全程约0.5-1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

用96孔板进行检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0204S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0204S-2	Lactate Assay Buffer	20ml
S0204S-3	Enzyme Solution	200μl
S0204S-4	Substrate	200μl
S0204S-5	WST-8	200μl
S0204S-6	D-Lactate Standard (100mM)	20μl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中WST-8须-20ºC避光保存。

注意事项：

本试剂盒仅能检测D-乳酸，不能检测L-乳酸。如需检测L-乳酸，可使用碧云天的L-乳酸检测试剂盒(WST-8法) (S0208)。

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、Lactate Assay Buffer需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它试剂使用时应在冰上进行。

底物从-20ºC取出在融解过程中可能会有析出，平衡至室温后析出的部分会复溶，不会对检测结果产生影响。

血清、血浆等样品如在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC或-80ºC保存。

为减少稀释液产生的背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其他样品时，宜使用Lactate Assay Buffer稀释。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的制备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100μl-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay，用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、Tissue Master™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下匀浆。将匀浆液在4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以置于-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接吸取培养液上清用于后续的测定；对于悬浮细胞，离心后吸取培养液上清用于后续的测定。
2.试剂盒的准备工作：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、Lactate Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用，其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.WST-8显色工作液(WST-8 Working Solution)的配制：按照每个检测反应50µl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合44μl Lactate Assay Buffer，2μl Enzyme Solution、2μl Substrate，2μl WST-8，即可配制成50µl WST-8显色工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的WST-8显色工作液，具体配制方法参考下表。配制好的WST-8显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Lactate Assay Buffer (μl)	44	440	880	2200
Enzyme Solution (μl)	2	20	40	100
Substrate (μl)	2	20	40	100
WST-8 (μl)	2	20	40	100
WST-8 Working Solution (µl)	50	500	1000	2500

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：NADH、NADPH等的存在会对D-乳酸的检测产生干扰。如果样品含有NADH、NADPH，需同时设置样品的背景对照孔，加入不含酶溶液的显色工作液，即配制WST-8显色工作液时2µl Enzyme Soulution用Lactate Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数值需要减去背景对照孔的读数。
3.D-乳酸标准曲线的设置：
取1μl D-Lactate Standard (100mM)，加入99μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或Lactate Assay Buffer (如果是细胞或组织裂解样品，使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果是血液等其它样品，使用Lactate Assay Buffer)，混匀，配制成100μl浓度为1mM D-Lactate Standard。分别取1mM的D-Lactate Standard 0、1、2.5、5、10、25、50μl加入96孔板的标准品孔中，并用对应的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或Lactate Assay Buffer补足至50μl，此时，标准曲线的各孔D-乳酸浓度和物质的量分别为0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1mM和0、1、2.5、5、10、25、50nmol。
4.样品测定：
a.取50μl步骤1制备的样品至96孔板样品孔中，同时设置仅含BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或Lactate Assay Buffer的孔为空白对照孔。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议样品同时设定多个稀释倍数，可以进行预实验确定样品的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数。当样品为细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其它样品时，宜使用Lactate Assay Buffer稀释。此处的样品稀释倍数记为n。
b.各孔加入WST-8显色工作液50μl，混匀。37ºC避光孵育30分钟。注：如果吸光度偏低，即孔板的颜色较浅，可适当延长反应时间至45或者60分钟；如果D-乳酸含量较高，即孔板的颜色较深，也可以缩短孵育时间为15或者20分钟。
c.在450nm测定吸光度。
d.将标准曲线各孔的信号值减去标准品零浓度孔的信号值。建立标准曲线，并计算样品中D-乳酸的浓度(A)，样品孔的信号值应减去空白对照孔的信号值，如果样品的背景对照孔信号比较高，样品的信号值需要减去样品背景对照值。D-乳酸标准曲线可以参考图2，在0.02-1mM浓度范围内有良好的线性关系。D-乳酸浓度计算公式如下：
C (mM) = A × n
注1：A为步骤4d中根据标准曲线确定的稀释后的样品D-乳酸浓度(mM)；
n为步骤4a中样品稀释倍数。
注2：计算获得的D-乳酸浓度其中包含了D-乳酸和D-乳酸根的摩尔浓度，也可以理解为包含了D-乳酸和D-乳酸盐的摩尔浓度。上述仅为了表述方便，仅描述为D-乳酸。如有必要，可根据D-乳酸根的分子量89.07计算出样品中D-乳酸根的质量浓度(μg/ml) = C × 0.08907。
参考文献：
1.Rattu, G., Khansili, N., Maurya, V.K. et al. Environ Chem Lett 19.2021. 1135–1152.
2.Ewaschuk JB, Naylor JM, Zello GA. J Nutr. 2005. 135(7):1619-25.
3.Li X, Yang Y, Zhang B, Lin X, Fu X, et al. Signal Transduct Target Ther. 2022. 7(1):372.
4.Petersen C. Nutr Clin Pract. 2005. 20(6):634-45.
5.Remund B, Yilmaz B, Sokollik C. Children (Basel). 2023. 10(6):945.
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