Exonuclease T
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产品编号 D6003M
数量
¥ 898.00
产品包装:
250U 1250U 5000U
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碧云天生产的Exonuclease T,即核酸外切酶T,也称RNase T,是一种从大肠杆菌中表达纯化获得的能够特异催化单链DNA或RNA从3'-5'方向降解的核酸外切酶[1]。Exonuclease T常用于单链DNA/RNA的消化,或将带有3'突出末端的双链DNA或双链RNA生成平末端[2]。

Exonuclease T对单链RNA和单链DNA 3'端外切酶的催化活性不同,对于单链DNA的活性要高很多。在标准反应条件下,完全消化1.0pmol的rA20需要1U的Exonuclease T。而1U的Exonuclease T 可以在30分钟内从50pmol Fam-labeled poly-dT酶切产生1nmol dT 。相当于两者的每活性相差约50倍左右。

Exonuclease T对3'端末端含有一个胞嘧啶的RNA底物,降解活性会降低100倍;对3'端末端含有两个连续的胞嘧啶的底物,没有降解活性。因此Exonuclease T难以降解3'端含有胞嘧啶的单链RNA。

碧云天生产的Exonuclease T用于催化降解双链DNA和单链DNA的效果可参考图1。

图1. 碧云天生产的Exonuclease T (D6003)用于催化降解双链DNA和单链DNA的效果图。A. 在20µl反应体系(50mM Potassium Acetate,20mM Tris-acetate,10mM Magnesium Acetate,1mM DTT (pH7.9 @ 25ºC))中加入20pmol的不同类型DNA底物,以及5U的Exonuclease T,25ºC孵育30分钟进行反应,反应完成后65ºC孵育20分钟以终止反应。取反应后产物5μl,加入1μl 6X DNA Loading Buffer (D0071),然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180V电泳60分钟),之后用NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128/D0130)室温染色5分钟,在紫外灯下观察实验结果。如图所示,碧云天生产的Exonuclease T可有效将ssDNA和3'突出的双链DNA,从3'-5'方向进行消化降解,但不能作用于平末端、5'突出的双链DNA。B. 在20µl反应体系(50mM Potassium Acetate,20mM Tris-acetate,10mM Magnesium Acetate,1mM DTT (pH7.9 @ 25ºC))中加入20pmol长度为50nt的ssDNA,以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的Exonuclease T,25ºC孵育30分钟进行反应,反应完成后65ºC孵育20分钟以终止反应。取反应后产物5μl,加入1μl 6X DNA Loading Buffer (D0071),然后进行1%琼脂糖凝胶电泳(140V电泳30分钟),在紫外灯下观察实验结果。如图所示,本产品与N公司的Exonuclease T产品相比,具有类似的消化降解ssDNA的效果。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异,图中所示结果仅供参考。

用途:去除双链DNA的3'突出末端生成平末端;DNA测序或SNP分析前,去除PCR反应中的单链引物;去除nested PCR中的单链引物;去除样品中的单链DNA,保留双链DNA [3]。

来源:纯化自携带编码大肠杆菌Exonuclease T基因的E.coli重组菌株。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme required to release 1nmol of single dT nucleotides from 50pmol of Fam-labeled polythymidine substrate in 30 minutes at 25ºC。

纯度:不含除Exonuclease T以外的其它种类的DNA/RNA外切酶,不含DNA/RNA内切酶。

酶储存液:10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 200µg/ml BSA, 50% Glycerol (pH7.4 @ 25ºC)。

10X Reaction Buffer :500mM Potassium Acetate, 200mM Tris-acetate, 100mM Magnesium Acetate, 10mM DTT (pH7.9 @ 25ºC)。

失活或抑制:65ºC孵育20分钟可使Exonuclease T失活。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D6003S-1 Exonuclease T (5U/µl) 50μl
D6003S-2 10X Reaction Buffer 0.25ml
- 说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D6003M-1 Exonuclease T (5U/µl) 250μl
D6003M-2 10X Reaction Buffer 1.25ml
- 说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D6003L-1 Exonuclease T (5U/µl) 1ml
D6003L-2 10X Reaction Buffer 5ml
- 说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,至少两年有效。

注意事项:

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 参考下表在冰浴中配制如下反应体系(以50μl体系为例):
Reagent Volume Final Concentration
Nuclease-Free Water (47-x)μl -
10X Reaction Buffer 2μl 1X
Substrate xμl (5nmol bases) 0.1nmol/µl
Exonuclease T 1μl 0.1U/µl
Total Volume 50μl -
注1:为获得最好的底物酶切效果,实验过程中可参考酶活单位定义对酶用量进行适当调整,摸索最优反应体系。
注2:如果同时进行多个反应,可以把上表中除Exonuclease T之外所有成分提前混合,分装到各反应管中,最后再加入Exonuclease T。
2. 按上表配制好反应体系后,适当轻轻混匀,随后低速离心使粘附在管壁上的液体沉至管底。
3. 反应条件:25ºC孵育30分钟。注:反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
4. 终止反应:65ºC孵育20分钟使Exonuclease T失去活性。
5. 取酶切消化后的产物进行琼脂糖凝胶或聚丙烯凝胶电泳分析,拍照观察并分析酶切效果。如果需要从琼脂糖凝胶中回收DNA样品,推荐使用D0056 DNA凝胶回收试剂盒;如果需要从酶切消化反应体系中纯化DNA样品,推荐使用D0033 PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒。
参考文献:
1. Zuo Y, Deutscher MP. J Biol Chem. 2002. 277(51): 50155-50159.
2. Zuo Y, Deutscher MP. J Biol Chem. 2002. 277(33): 29654-29661.
3. Hsiao YY, Fang WH, Lee CC, Chen YP, Yuan HS. PLoS Biol. 2014. 12(3): e1001803.
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