Klenow Fragment, Exo-
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产品编号 D7041M
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¥ 505.00
产品包装:
200U 1000U 5000U
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Klenow Fragment, Exo-,即没有外切酶活性的Klenow片段,是大肠杆菌聚合酶I (E.coli. DNA polymerase I)的大片段(Large Fragment)缺失了外切酶活性的突变体。Klenow Fragment, Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性,但缺少完整的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。

特点:由于Klenow Fragment, Exo-没有外切酶活性,其在末端补平时经常会在3'末端额外加上1个或多个核苷酸,因此不能用于产生平末端而用于后续的连接。

碧云天生产的Klenow Fragment, Exo-补平双链DNA 5'突出(5' overhang)末端的效果请参考图1。

图1.碧云天生产的Klenow Fragment, Exo-补平双链DNA 5'突出(5' overhang)末端的效果图。在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或T公司(Competitor)的Klenow Fragment, Exo-,37℃孵育10min进行反应,75℃孵育10min以终止反应。取出5μl,加入1μl 6X DNA Loading Buffer,然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,之后用NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128)室温染色15min,在紫外灯下观察实验结果。如图所示,本产品与T公司的产品相比,具有类似的催化效果。反应体系(20μl):50mM Tris-HCl (pH8.0 at 25℃), 5mM MgCl2, 1mM DTT, 50µM dNTP Mix, 0.5µM dsDNA with 5' overhang。dsDNA with 5' overhang (也称具有5'突出末端的双链DNA)是使用D0251 Annealing Buffer for DNA Oligos (5X)按照该产品说明书推荐的程序,把 5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'和5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'这两条寡核苷酸进行退火反应得到的产物。

碧云天生产的Klenow Fragment, Exo-不会打平双链DNA 3'突出(3' overhang)末端的效果请参考图2。

图2.碧云天生产的Klenow Fragment, Exo-不会打平3'突出(3' overhang)末端的效果图。在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或本公司的Klenow Fragment,37℃孵育10min进行反应,75℃孵育10min以终止反应。取出5μl,加入1μl 6X DNA Loading Buffer,然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,之后用NA-Red D0128 (EB升级换代产品,2000X)室温染色15min,在紫外灯下观察实验结果。如图所示,与本公司的Klenow Fragment相比,本产品不具有打平3'突出末端的活性。反应体系(20μl):50mM Tris-HCl (pH8.0 at 25℃), 5mM MgCl2, 1mM DTT, 50µM dNTP Mix, 0.5µM dsDNA with 3' overhang。dsDNA with 3' overhang (也称具有3'突出末端的双链DNA)是使用D0251 Annealing Buffer for DNA Oligos (5X)按照该产品说明书推荐的程序,把 5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'和5'-GTCTATGTATCTATGTAT-3'这两条寡核苷酸进行退火反应得到的产物。

用途:5'突出末端的标记;随机引物法进行DNA标记;Sanger双脱氧法进行DNA测序等。

来源:由大肠杆菌表达,表达基因的来源为突变的polA基因片段。

分子量:约68kDa(单体)。

活性定义:37℃ 30分钟内,催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。

酶活性检测条件:67mM potassium phosphate (pH7.4), 6.7mM MgCl2, 1mM 2-mercaptoethanol, 0.033mM dATP, 0.033mM dTTP, 0.4MBq/ml [3H]-dTTP, 62.5µg/ml poly(dA-dT)•poly(dA-dT).

纯度:不含DNA内切酶,不含RNase。

酶储存溶液:25mM Tris-HCl (pH7.5), 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) glycerol.

Reaction Buffer (10X):500mM Tris-HCl (pH8.0 at 25℃), 50mM MgCl2, 10mM DTT.

缓冲液兼容性:在碧云天的内切酶反应缓冲液1X O、1X R、1X Y 、2X Y中的活性为100%,在1X B、1X G中的活性为100%;在碧云天的Taq、Pfu DNA polymerase和M-MuLV反应缓冲液中的活性为100%。

失活或抑制:75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment, Exo-失活。金属离子螯合剂,无机焦磷酸盐(PPi),大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment, Exo-有抑制作用。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7041S-1 Klenow Fragment, Exo- (5U/µl) 40µl
D7041S-2 Reaction Buffer (10X) 200µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7041M-1 Klenow Fragment, Exo- (5U/µl) 200µl
D7041M-2 Reaction Buffer (10X) 1ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7041L-1 Klenow Fragment, Exo- (5U/µl) 1ml
D7041L-2 Reaction Buffer (10X) 5ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

酶使用时宜放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.随机引物法进行DNA标记:
a.参考如下表格设置反应体系:
Reagent Volume
DNA 10µl (100ng)
Reaction Buffer (10X) 5µl
125µM random decamer or hexamer primer 10µl
补充无核酸酶的去离子水 至40µl
混匀后沸水浴孵育5-10分钟,立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液
3 dNTP Mixture (0.25mM each , without the labeled dNTP) 4µl
[α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000Ci/mmol) 1.85MBq (50µCi)
Klenow Fragment, Exo- 1µl (5U)
补充无核酸酶的去离子水 至50µl
b.按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c.对于random decamer primer,37℃孵育5分钟;对于random hexamer primer,37℃孵育10分钟。
d.加入4µl 0.25mM dNTP,混匀后37℃孵育5分钟。
e.加入1µl 0.5M EDTA,pH8.0终止反应。
f.取1µl上述液体用于检测标记的效率。
g.用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。
2.双链DNA 5'突出(5' overhang)末端的标记:
a.参考如下表格设置反应体系:
Reagent Volume
Digested DNA 10~15µl (0.1~4µg)
Reaction Buffer (10X) 2µl
[α-32P]-dNTP, ~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol) 0.74 MBq (20µCi)
或 [α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol) 2.96 MBq (80µCi)
3 dNTP Mixture (2.5mM each , without the labeled dNTP) 2µl
Klenow Fragment, Exo- 0.2µl (1U)
补充无核酸酶的去离子水 至20µl
b.按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c.30℃孵育15分钟。
d.75℃孵育10分钟终止反应。
3.双链DNA 5'突出末端的补平:
a.对于双链DNA 5'突出(5' overhang)末端的补平,参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
Reagent Volume Final Concentration
Nuclease-Free Water (16.6-x)µl -
dsDNA with 5’ Overhang xµl ~0.5µM or 5-200ng/µl
Reaction Buffer (10X) 2µl 1X
dNTP Mix (2.5mM each) 0.4µl 50µM
Klenow Fragment, Exo- (5U/µl) 1µl 0.25U/µl
Total Volume 20µl -
注1:按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体;如果同时进行多个反应,可以把上表中除dsDNA with 5’ overhang之外的所有溶液和酶提前混合,分装到各反应管,最后再加入dsDNA with 5’ overhang。
注2:dsDNA with 5’ Overhang如果是寡核苷酸,最终浓度可以约为0.5µM,如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为 5-200ng/µl。
b.37℃孵育10分钟。
c.75℃孵育10分钟以终止反应。
4.其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。
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