碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I，即大肠杆菌DNA聚合酶I，是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种DNA模板依赖的DNA聚合酶，可以在单链DNA模板和与其配对的引物存在的条件下，催化5'→3'方向的DNA合成[1]。E.coli DNA Polymerase I同时还具备双链DNA缺刻(nick)处特异性的5'→3'外切酶活性、单链特异性的3'→5'外切酶活性以及核糖核酸酶H活性[2]。E.coli DNA Polymerase I的DNA合成酶活性和双链DNA缺刻(nick)处特异性的5'→3'外切酶活性，可以实现缺刻处3'-OH起始的DNA合成和5'端单链DNA的降解，实现缺口平移。E.coli DNA Polymerase I的单链特异性的3'→5'外切酶活性可以起到DNA合成的校验作用(proofreading)。在有dNTP存在的情况下，E.coli DNA Polymerase I更多地表现为DNA聚合酶活性；而当dNTP不存在的情况下，E.coli DNA Polymerase I更多表现为单链特异性的外切酶活性，例如可以表现为平末端双链DNA中的任一条链的5'端的5'→3'外切酶活性。

E.coli DNA Polymerase I的多功能性可实现以双链DNA中的缺刻或缺口为起点合成新的DNA链；从缺口处降解与模板链互补的DNA链，实现DNA的缺口平移；保证DNA复制过程中错配的校对，并对复制和修复中出现的空隙进行填补[3]。

碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I补平双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的效果参考图1。

图1. 碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I (D7043)补平双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的效果图。在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的E.coli DNA Polymerase I，37ºC孵育20分钟进行反应，反应完成后75ºC孵育20分钟以终止反应。取出5μl反应产物，加入1μl 6X DNA Loading Buffer (D0071)，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。180V电泳60分钟，之后用Gel-Red (EB升级换代产品，10000X) (D0139)室温染色5分钟，在紫外灯下观察实验结果。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20µl): 10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 100µM dNTP Mix, 0.5µM dsDNA with 5' overhang (pH7.9 @ 25ºC)。dsDNA with 5' overhang (也称具有5'突出末端的双链线性DNA)是使用Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251)并按照该产品说明书推荐的程序，把5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'和5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'这两条寡核苷酸链进行退火反应得到的产物，并以此退火产物为底物，进行双链DNA 5'突出末端的补平。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。

碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I对3'端带有氨基修饰的双链线性DNA消化(5'→3'外切酶活性)的效果参考图2。

图2. 碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I (D7043)对3'端带有氨基修饰的双链线性DNA消化(5'→3'外切酶活性)的效果图。在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的E.coli DNA Polymerase I，37ºC孵育20分钟进行反应，反应完成后75ºC孵育20分钟以终止反应。取出5μl反应产物，加入1μl 6X DNA Loading Buffer (D0071)，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。180V电泳60分钟，之后用Gel-Red (EB升级换代产品，10000X) (D0139)室温染色5分钟，在紫外灯下观察实验结果。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20μl)：10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 0.5µM dsDNA。3'端带有氨基修饰的单链DNA不会被E.coli DNA Polymerase I 的3'→5'外切酶活性所降解。3'端带有氨基修饰的dsDNA是使用Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251)并按照该产品说明书推荐的程序，把5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'NH2和5'-GTAAAACGACGGCCAGTCTATGTATCTATGTAT-3'NH2这两条寡核苷酸链进行退火反应得到的产物，并以此退火产物为底物，进行双链线性DNA消化。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。

用途：DNA合成；双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的补平；双链DNA 3'突出末端(3' overhang)的削平；cDNA第二条链合成[4]；与DNase I一起使用，进行DNA切口平移；DNA的切口翻译以获得具有高比活性的探针。

来源：纯化自携带编码E.coli DNA Polymerase I基因的E.coli重组菌株。

活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10nmol of dNTP into acid insoluble material in 30 minutes at 37°C.

纯度：不含除E.coli DNA Polymerase I之外的其它种类的DNA外切酶，不含内切酶，不含RNase。

酶储存液：25mM Tris-HCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol (pH7.4 @25ºC)。

10X Reaction Buffer: 100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 100mM MgCl2, 10mM DTT (pH7.9 @25ºC)。

失活或抑制：75ºC孵育20分钟可使E.coli DNA Polymerase I失活。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D7043S-1	E.coli DNA Polymerase I (10U/μl)	25μl
D7043S-2	10X Reaction Buffer	100μl
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
D7043M-1	E.coli DNA Polymerase I (10U/μl)	100μl
D7043M-2	10X Reaction Buffer	400μl
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
D7043L-1	E.coli DNA Polymerase I (10U/μl)	500μl
D7043L-2	10X Reaction Buffer	2ml
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，两年有效。

注意事项：

由于E.coli DNA Polymerase I具有外切酶活性，在进行反应前应尽量避免环境温度偏高导致的DNA链被切除。

E.coli DNA Polymerase I不具有内切酶活性，且本产品不包含DNase I，进行切口翻译反应时必须另外添加DNase I。

对E.coli DNA Polymerase I剧烈震荡或搅拌会使酶失活。

E.coli DNA Polymerase I与DNA的亲和力较高，加入过量的酶易发生凝集作用(Aggregation)，影响反应的进行。

E.coli DNA Polymerase I可使用带修饰的核苷酸(例如生物素、地高辛、荧光标记核苷酸)作为DNA合成的底物，以用于DNA探针的标记。

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的补平：
a. 对于双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的补平，参考下表在冰浴中配制反应体系(以20μl体系为例)。

Reagent	Volume	Final Concentration
Nuclease-Free Water	(16-x)μl	-
dsDNA with 5' overhang	xμl	~0.5µM or 5-200ng/µl
10X Reaction Buffer	2μl	1X
dNTP Mix (2mM each)	1μl	100μM
E.coli DNA Polymerase I (10U/µl)	1μl	0.5U/µl
Total Volume	20μl	-

注1：在进行末端补平实验时可适当减少酶量，避免在外切酶活性的作用下导致模板的缺失。
注2：如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA with 5' overhang之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA with 5' overhang。
注3：dsDNA with 5' overhang如果是寡核苷酸，最终浓度可以约为0.5µM；如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为5-200ng/μl。
b. 按上表设置好反应体系后，适当轻轻混匀反应体系，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
c. 反应条件：37ºC孵育20分钟。注：反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
d. 终止反应：75ºC孵育20分钟使E.coli DNA Polymerase I失去活性。
2. 双链线性DNA的消化：
a. 对于双链线性DNA消化，参考下表在冰浴中配制如下反应体系(以20μl体系为例)。

Reagent	Volume	Final Concentration
Nuclease-Free Water	(17-x)μl	-
dsDNA	xμl	~0.5µM or 5-200ng/µl
10X Reaction Buffer	2μl	1X
E.coli DNA Polymerase I (10U/µl)	1μl	0.5U/µl
Total Volume	20μl	-

注：如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA。
b. 按上表设置好反应体系后，适当轻轻混匀反应体系，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
c. 反应条件：37ºC孵育20分钟。注：反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
d. 终止反应：75ºC孵育20分钟使E.coli DNA Polymerase I失去活性。
3. 其它用途可以参考适当的文献资料进行。
常见问题：
1. E.coli DNA Polymerase I能补平3'突出末端吗？
不能，E.coli DNA Polymerase I只能通过移除3'突出末端的方式形成平末端。E.coli DNA Polymerase I (D7043)、Klenow Fragment (D7037)、T4 DNA Polymerase(D7052)是削平3'突出末端的最佳选择。
2. E.coli DNA Polymerase I能补平DNA的5'突出末端吗？
可以，5'突出末端会被补平，3'突出末端会被削平。Klenow Fragment (D7037)缺乏5'→3'外切酶活性，是补平DNA的5'突出末端的首选酶。
3. E.coli DNA Polymerase I能用于切口平移实验吗？
能，切口平移实验是该酶的重要应用之一。
4. 切口平移实验时有温度要求吗？
切口平移时的孵育温度应低于20ºC。在较高的温度下，新合成的链可以分离并被复制。
5. E.coli DNA Polymerase I可以热失活吗？
可以。反应结束后添加10mM EDTA螯合Mg2+，当温度升高时，可以保护DNA末端，然后在75ºC加热20分钟即可将酶灭活。
6. E.coli DNA Polymerase I能移除5'突出末端吗？
不能，E.coli DNA Polymerase I的5'→3'外切酶活性仅适用于双链DNA缺刻处。
7. DNA切口平移能够用来做标记探针吗？
可以，DNA聚合酶I用5'→3'核酸外切酶去除缺口处的前导碱基，并用标记的碱基填充。该方法适于制作大而均匀的探针，但比活性不高。
参考文献：
1. Kunkel TA, Loeb LA, Goodman MF. J Biol Chem. 1984. 259(3):1539-45.
2. Green MR, Sambrook J. Cold Spring Harb Protoc. 2020. 2020(5):100743.
3. Yu H, Chao J, Patek D, Mujumdar R, Mujumdar S, Waggoner AS. Nucleic Acids Res. 1994. 22(15):3226-32.
4. D'Alessio JM, Gerard GF.Nucleic Acids Res. 1988. 16(5):1999-2014.
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产品编号	产品名称	包装
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D7037S	Klenow Fragment	200U
D7037M	Klenow Fragment	1000U
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D7053M	phi29 DNA Polymerase	1kU
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D7041M	Klenow Fragment, Exo-	1000U
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