RNase III (dsRNA-specific)
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产品编号 R7086M
数量
¥ 1598.00
产品包装:
200U 1KU 5KU
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碧云天生产的RNase III,即核糖核酸酶III,是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种来源于大肠杆菌的双链RNA (Double-strand RNA, dsRNA)特异性的核糖核酸酶。在锰离子(Mn2+)存在的反应缓冲液中,RNase III可特异性地将较长的双链RNA (dsRNA)切割成长度约为18-25bp的3'羟基末端带有2-3个突出碱基的干扰RNA (siRNA) [1,2],该产物与Dicer酶切产生的底物类似,具有用于哺乳动物细胞的RNA干扰(RNA interference)、基因沉默、靶标确认等多种用途[3]。RNase III不能水解DNA或单链RNA。

碧云天生产的RNase III用于切割500bp双链RNA生成siRNA的效果请参考图1。

图1. 碧云天生产的RNase III (R7086)切割500bp双链RNA生成siRNA的效果图。使用本产品或N公司(Competitor)的RNase III,在10µl反应体系(50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 1mM DTT, 20µM MnCl2 (pH7.5 @25ºC))中加入1µg 500bp的dsRNA,以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的RNase III,然后用超纯水(ST876)补至10µl,37ºC孵育20分钟进行反应。反应完成后立即加入终浓度为50mM的EDTA以终止反应。取反应后产物10μl加入2μl 6X DNA Loading Buffer (D0071),1%的琼脂糖凝胶电泳,随后在紫外灯下观察实验结果。如图所示,本产品与N公司的RNase III产品相比,对500bp的dsRNA具有类似的酶切效果。dsRNA是使用T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit (R7016)将两条含T7启动子的500bp的互补DNA链进行体外转录生成两条互补的500nt单链RNA,随后使用Annealing Buffer for RNA Oligos (5X) (R0051)并按照该产品说明书推荐的程序,把这两条互补的500nt单链RNA进行退火反应得到的产物。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异,图中所示结果仅供参考。

用途:dsRNA的水解酶切;产生siRNA;基因沉默;基因靶标确认 (target validation)。

来源:纯化自携带编码大肠杆菌RNase III基因的E.coli重组菌株。

活性定义: One unit is the amount of enzyme required to digest 1µg of dsRNA to siRNA in 20 minutes at 37ºC in a total reaction volume of 50µl.

纯度:不含除RNase III之外的其它种类的RNA内切酶和外切酶,不含DNase。

酶储存液:10mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 1mM DTT, 0.5mM EDTA, 50% Glycerol (pH8.0 @25ºC)。

10X Reaction Buffer: 500mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 10mM DTT (pH7.5 @25ºC).

失活或抑制:不能进行热失活;加入反应终止液10X EDTA(终浓度为50mM EDTA)可使RNase III失活。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R7086S-1 RNase III (2U/μl) 100μl
R7086S-2 10X Reaction Buffer 0.2ml
R7086S-3 10X EDTA 0.2ml
R7086S-4 10X MnCl2 0.2ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7086M-1 RNase III (2U/μl) 500μl
R7086M-2 10X Reaction Buffer 1ml
R7086M-3 10X EDTA 1ml
R7086M-4 10X MnCl2 1ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7086L-1 RNase III (2U/μl) 2.5ml
R7086L-2 10X Reaction Buffer 5ml
R7086L-3 10X EDTA 5ml
R7086L-4 10X MnCl2 5ml
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,两年有效。

注意事项:

RNase III不能进行热失活,否则会降低siRNA的产率;可通过加入终浓度为50mM的EDTA以终止反应。

RNA极易降解,在整个操作过程中应尽可能避免环境中RNase的影响。

RNase III使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. siRNA的制备:
a. 对于siRNA的制备,参考下表在冰浴中配制如下反应体系(以20和100μl体系为例):
Reagent Volume Volume Final Concentration
dsRNA xμl (2μg) xμl (10μg) 100ng/µl
10X Reaction Buffer 2μl 10μl 1X
10X MnCl2 2μl 10μl 1X
Nuclease-Free Water (14-x)μl (70-x)μl -
RNase III 2μl 10μl 0.2U/µl
Total Volume 20μl 100μl
注1:为获得最好的底物酶切效果,实验过程中可参考酶活单位定义对酶用量进行适当调整,摸索最优反应体系。
注2:如果同时进行多个反应,可以把上表中除RNase III之外所有成分提前混合,分装到各反应管中,最后再加入RNase III。
b. 按上表设置好反应体系后,适当轻轻混匀反应体系,随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
c. 反应条件:37ºC孵育20分钟。
注:反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
d. 终止反应:加入反应终止液10X EDTA(终浓度为50mM EDTA)使RNase III失去活性。
注:不能进行热失活,热失活会降低siRNA的产率。
2. 其它用途可以参考适当的文献资料进行。
参考文献:
1. Morlighem JE, Petit C, Tzertzinis G. Biotechniques. 2007. 42(5):599-600, 602, 604-6.
2. Court DL, Gan J, Liang YH, Shaw GX, Tropea JE, et al. Annu Rev Genet. 2013. 47:405-31.
3. Donzé O, Picard D. Nucleic Acids Res. 2002. 30(10):e46.
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