碧云天生产的Thermostable RNase H，即耐热RNase H，是一种在较高温度(65℃以上)时仍然保持活性的核糖核酸内切酶(endoribonuclease)。Thermostable RNase H可以选择性识别并酶切RNA:DNA杂合双链中的RNA的磷酸二酯键，同时杂合双链中的DNA会保持完整。Thermostable RNase H不会降解单链或双链的RNA或DNA。

Thermostable RNase H在65℃以上温度时仍具有很高的酶活性，其在70℃时的半衰期可达几个小时，在高达95℃时的半衰期仍可达30分钟左右。 该酶的耐高温特性使得异源双链RNA:DNA杂交分子具有更高的特异性，并在较高温度下更特异性地降解杂合双链中的RNA。Thermostable RNase H具有与常见的E. coli RNase H具有类似的酶学性质，但E. coli RNase H在高于55℃时即失活。

Thermostable RNase H与E. coli RNase H的热稳定性比较请参考图1。

图1. 碧云天生产的R7090 Thermostable RNase H与E. coli RNase H的热稳定性比较。在20µl反应体系中加入图中指定量的Thermostable RNase H或E. coli RNase H，在65℃孵育20min后，Thermostable RNase H和E. coli RNase H分别按照其标准的反应条件(Thermostable RNase H 50℃孵育20min；E. coli RNase H 37℃孵育20min)进行RNA:DNA杂交链的酶切反应，反应完毕后立即冰浴3-5分钟并加入1μl 0.5M EDTA终止反应。取出5μl反应液，加入1μl 6×DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(冰浴条件下180V电泳45min；之后用NA-Red (D0128 NA-Red (EB升级换代产品, 2000X))室温染色15min，即可拍照观察结果)。如图所示，E. coli RNase H在65℃时失去活性，而Thermostable RNase H在65℃时仍保持活性。热稳定性比较反应体系(20μl)：Thermostable RNase H：50mM Tris-HCl (pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT, 400ng RNA:DNA杂合双链以及不同量的Thermostable RNase H (包括未经热处理和在65℃孵育20min热处理)，50℃孵育20min；E. coli RNase H：20mM Tris-HCl (pH 7.8), 40mM KCl, 8mM MgCl2, 1mM DTT, 400ng RNA:DNA杂合双链以及不同量的E. coli RNase H (包括未经热处理和在65℃孵育20min热处理)，37℃孵育20min。

碧云天生产的Thermostable RNase H催化降解RNA:DNA杂合双链中的RNA链的效果请参考图2：

图2. 碧云天生产的R7090 Thermostable RNase H和竞争公司的同类产品的效果比较图。使用本产品或N公司(Competitor)的Thermostable RNase H，在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或国外N公司的Thermostable RNase H，50℃孵育20min进行反应，反应完毕后立即冰浴3-5分钟并加入1μl 0.5M EDTA以终止反应。取出5μl反应液，加入1μl 6×DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(冰浴条件下180V电泳45min；之后用NA-Red (D0128 NA-Red (EB升级换代产品, 2000X))室温染色15min，即可拍照观察结果)。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果。RNA:DNA杂合双链反应体系(20μl)：50mM Tris-HCl (pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT, 400ng RNA:DNA杂合双链以及不同量的Thermostable RNase H，50℃孵育20min。

用途：高严谨度的RNA结构图谱的描绘和位点特异性RNA切割；与oligo (dT)杂交的mRNA的poly (A)尾的酶切去除；cDNA合成后去除mRNA；用于等温扩增实验；用于和特定DNA序列杂交后酶切去除特定的RNA序列，例如rRNA的去除等。

来源：大肠杆菌表达的重组蛋白。

活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to produce 1 nmol of ribonucleotides from 40 pmol of a fluorescently labeled 25 base pair RNA:DNA hybrid in a total reaction volume of 50 µl in 20 minutes at 50℃。

纯度：纯度大于95%，不含DNA内切酶和外切酶，不含其它核糖核酸酶。

酶储存溶液：50mM Tris-HCl (pH7.5), 100mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton® X-100, 50% (v/v) Glycerol。

10XReaction Buffer：500mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃), 750mM KCl, 30mM MgCl₂, 100mM DTT。

失活或抑制：加入适量蛋白酶K消化或加入5%体积的0.5M EDTA pH8.0。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R7090S-1	Thermostable RNase H (5U/µl)	50µl
R7090S-2	10X RNaseH Reaction Buffer	150µl
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
R7090M-1	Thermostable RNase H (5U/µl)	200µl
R7090M-2	10X RNaseH Reaction Buffer	500µl
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
R7090L-1	Thermostable RNase H (5U/µl)	1ml
R7090L-2	10X RNaseH Reaction Buffer	2ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存，至少一年有效。

注意事项：

本产品的最佳反应温度高于65℃，在95℃时仍具有活性，其在65℃时的活性是在37℃时的3-4倍。

本产品在使用说明中建议的反应温度是50℃，在实际实验操作中可以酌情通过提高反应温度提高其酶活性。

本产品的反应缓冲液中包含MgCl₂，当Thermostable RNase H在高温时应用于RNA/DNA杂交链或者RNA样品时，建议适当限制反应时间和温度，以减少金属介导的单链RNA降解。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.RNA/DNA杂合双链的退火。
将单链RNA和DNA等摩尔数混合，推荐的终浓度为20µM，90℃孵育1min，然后通过梯度降温至25℃退火形成RNA:DNA杂交双链。推荐使用碧云天生产的R0051 Annealing Buffer for RNA oligos (5X)，并按照该产品的使用说明进行退火反应。退火后的双链如果不立即用于后续的翻译，推荐在-80℃保存。
2.反应体系的设置。对于RNA:DNA杂合双链中的RNA链的降解，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。

Reagent	Volume	Final Concentration
DEPC-treated Water	(17-x)µl	-
RNA:DNA hybrid	xµl	0.1µg/µl or less
10X RNase H Reaction Buffer	2µl	1X
Thermostable RNase H (5U/µl)	1µl	0.25U/µl
Total Volume	20µl	-

注意：
a.由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。
b.如果同时进行多个反应，可以把上表中除RNA:DNA杂合双链之外的所有溶液和酶提前混合，然后再分装到各反应管。
c.RNA:DNA杂合双链的用量可以是2µg或者更少。通常上述反应体系中的杂合双链的量不超过2µg，可以确保酶切充分。
3.酶切反应：50℃孵育20min。
如果发现效果欠佳，可以根据杂合双链的稳定性尝试将反应温度提高至65℃或更高温度(65℃时的酶活性约是50℃时的3倍)，也可以考虑适当延长反应时间。对于去除总RNA的复杂RNA体系中的特定RNA的反应体系，酶切反应的温度可以适当摸索，例如适当提高酶切的温度，以确保更高的酶切特异性。
4.终止反应：反应结束后加入蛋白酶K或1µl 0.5M EDTA pH8.0，终止反应。
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
D7089	RNase H	100U
R7090S	Thermostable RNase H	250U
R7090M	Thermostable RNase H	1000U
R7090L	Thermostable RNase H	5000U