T3 RNA Polymerase
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产品编号 R7009XL
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¥ 4867.00
产品包装:
1KU 5KU 25KU 100KU
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T3 RNA Polymerase,即T3 RNA聚合酶,是一种高度特异识别T3启动子序列的DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶。T3 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T3 启动子下游NTP的掺入,合成与T3启动子下游的模板DNA互补的RNA。

特点:T3 RNA Polymerase不仅可以进行常规的RNA合成,还可以识别修饰的NTP,例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP,可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T3启动子有高度的特异性。

碧云天生产的T3 RNA Polymerase以带有T3 Promoter的线性化质粒DNA为模板进行转录时的效果参见图1。

图1. 碧云天生产的T3 RNA Polymerase与同类产品(Competitor)以带有T3 Promoter的线性化质粒DNA为模板进行体外转录时的效果图。在20µl反应体系(40mM Tris-HCl, pH7.9, 2mM Spermidine, 6mM MgCl2, 1mM DTT)中,加入0.2μg线性化质粒DNA,以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的T3 RNA Polymerase,37℃孵育2h,70℃孵育10min终止反应,加入2U DNase I (D7073),37℃孵育15min消化模板DNA,得到的RNA转录产物为221nt。取出5μl反应产物,加入5μl 2X RNA Loading Buffer,70℃变性10min,然后进行1%琼脂糖凝胶电泳,用1X TAE作为电泳液,170V电泳5min,染色后拍照观察结果。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有相近或略优的转录效果。

用途:用于RNA合成,合成的RNA可以用于或用作:杂交探针,基因组DNA序列分析,核糖核酸酶保护测定(RNase protection assay),反义RNA合成,作为体外翻译的RNA模板,RNA剪接研究的底物,RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用,核酸扩增分析,siRNA、miRNA等小RNA。

来源:由大肠杆菌表达,表达基因为嗜菌体T3 RNA Polymerase基因。

活性定义:37℃ 60分钟内,催化1 nmol AMP 掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。

活性检测条件:40mM Tris-HCl (pH8.0),6mM MgCl2,10mM DTT,2mM spermidine,0.5mM NTP,0.6MBq/ml [3H]-ATP,20µg/ml plasmid DNA containing the specific T3 RNA Polymerase promoter sequence。

纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶。

酶储存溶液:50mM Tris-HCl (pH7.9, 25℃), 100mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 50% (v/v) Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100.

Transcription Buffer (10X):400mM Tris-HCl (pH7.9, 25℃), 20mM spermidine, 60mM MgCl2, 10mM DTT.失活或抑制:70℃加热10分钟可使T3 RNA Polymerase失活。加入适量EDTA也可以使T3 RNA Polymerase失活。螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制T3 RNA Polymerase的活性。

T3 consensus promoter sequence如下,其中的G为转录的第一个碱基。

AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R7009S-1 T3 RNA Polymerase (50U/µl) 20µl
R7009S-2 10X T3 Transcription Buffer 25µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7009M-1 T3 RNA Polymerase (50U/µl) 100µl
R7009M-2 10X T3 Transcription Buffer 120µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7009L-1 T3 RNA Polymerase (50U/µl) 500µl
R7009L-2 10X T3 Transcription Buffer 600µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7009XL-1 T3 RNA Polymerase (50U/µl) 2.0ml
R7009XL-2 10X T3 Transcription Buffer 1.2ml×2
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.RNA合成:
a.DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
b.酚/氯仿抽提DNA,用乙醇沉淀后,溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒,例如碧云天的DNA纯化试剂盒(D0033),直接进行纯化,从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
c.参考如下表格设置反应体系:
10X T3 Transcription Buffer 2µl
NTP Mixture (10mM each) 4µl
线性DNA模板 0.2-1µg
Ribonuclease Inhibitor (40U/µl) 0.5µl
T3 RNA Polymerase (50U/µl) 0.8-2µl U
补充经DEPC处理的去离子水 至20µl
d.按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
e.37℃孵育1~2个小时。
f.加入2µl 0.5M EDTA (pH 8.0)到反应体系中混匀或-20℃冷却终止反应。
g.电泳分析转录产物,或通过其他适当方法鉴定转录的效率。
注意:
a)转录需在无RNA酶条件下进行。
b)反应体系需在室温条件下配置,4℃有亚精胺(spermidine)存在时DNA可发生沉淀。
c)按以上反应条件,每1µg模板DNA可合成超过10µg的RNA。
d)如果模板DNA的线形化不太完全,会导致转录出比预期长度更长的RNA,同时使预期长度的转录本比例下降。
e)可根据实际情况按照比例放大或缩小上述反应体系。
2.放射标记RNA的合成:
a.DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
b.酚/氯仿抽提DNA,用乙醇沉淀后,溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒,例如碧云天的DNA纯化试剂盒(D0033),直接进行纯化,从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
c.参考如下表格设置反应体系:
10X T3 Transcription Buffer 2µl
3 NTP Mixture (10mM each , without CTP) 1µl
100µM CTP 2.4µl
[α-32P]-CTP, ~30TBq/mmol(800Ci/mmol) 1.85MBq(50µCi)
线性DNA模板 0.2~1µg
Ribonuclease Inhibitor (40U/µl) 0.5µl
T3 RNA Polymerase (50U/µl) 1µl
补充经DEPC处理的去离子水 至20µl
d.37℃孵育1~2个小时。
e.-20℃冷却终止反应。
f.分析和检测RNA的标记效率。
注意:
a)按以上方法合成的RNA活性一般为3-5 x108 dpm/µg。
b)上述标记反应中也可以使用[32 P]、[35 S]或[3H]标记的其他NTP。使用其他放射性标记的NTP时,其他的NTP需作相应调整。20µl反应体系各成分推荐使用剂量分别为:1.85MBq (50µCi) 5'-[α-32P]-CTP, ~30TBq/mmol(800Ci/mmol);11.1MBq (300µCi) 5'-[α-35S]-UTP, >37TBq/mmol (>1000Ci/mmol);0.925MBq (25µCi) 5,6-[3H]-UTP, 1.1-2.2TBq/mmol (30-60Ci/mmol)。
c)放射性标记NTP浓度低于12µM时,全长转录本合成效率也会下降。
3.生物素标记、地高辛标记等其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。
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D7378-250µl ATP (100mM, Nuclease free) 250µl
D7378-1ml ATP (100mM, Nuclease free) 1ml
D7378-5ml ATP (100mM, Nuclease free) 5ml
D7379-250μl CTP (100mM, Nuclease free) 250µl
D7379-1ml CTP (100mM, Nuclease free) 1ml
D7379-5ml CTP (100mM, Nuclease free) 5ml
D7380-250μl GTP (100mM, Nuclease free) 250μl
D7380-1ml GTP (100mM, Nuclease free) 1ml
D7380-5ml GTP (100mM, Nuclease free) 5ml
D7381-250μl UTP (100mM, Nuclease free) 250μl
D7381-1ml UTP (100mM, Nuclease free) 1ml
D7381-5ml UTP (100mM, Nuclease free) 5ml
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