5' DNA/RNA Adenylase
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产品编号 R0719M
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¥ 2998.00
产品包装:
3kU 15kU
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碧云天生产的5’ DNA/RNA Adenylase,即5'端DNA/RNA腺苷酰化酶,也称Single-Strand Nucleic Acid 5' Adenylase或单链核酸5'端腺苷酰化酶,可以催化5'端磷酸化的单链DNA或单链RNA (pDNA or pRNA)转换生成5'端腺苷酰化DNA (AppDNA)或5'端腺苷酰化RNA (AppRNA)。无论作为底物的DNA或RNA的3'端是否进行了氨基化等封闭,使用本产品都可以高效催化产生5'端腺苷酰化产物。在反应体系中不存在ATP的条件下,本产品还可以催化5'端磷酸化的单链DNA (pDNA)生成环状DNA (circular DNA)。

5' DNA/RNA Adenylase进行5'端腺苷酰化修饰反应时,需要ATP和待腺苷酰化修饰的5'端磷酸化的单链DNA或单链RNA。

5' DNA/RNA Adenylase催化单链核酸5'端腺苷酰化反应的原理如下:以5'端磷酸化的单链DNA或单链RNA为底物,本产品首先将ATP分解成AMP和PPi,接着AMP转移到单链DNA或单链RNA的5'磷酸基团上,之后形成腺苷酰化单链DNA或单链RNA,从而生成腺苷酰化产物。

碧云天生产的5' DNA/RNA Adenylase催化5'端磷酸化的单链DNA (pDNA)生成腺苷酰化DNA (AppDNA)的效果请参考图1。

图1.碧云天生产的5' DNA/RNA Adenylase催化5'端磷酸化的单链DNA (pDNA)转化成腺苷酰化DNA (AppDNA)的效果图。在20µl反应体系中加入5µM pDNA,0.1mM ATP,图中指定量的5' DNA/RNA Adenylase (5' DNA/RNA adenylase),65℃分别孵育1h和2h,反应完毕后85℃孵育5min以终止反应。然后每个样品各取1.5µl反应产物,加入2µl 6X DNA Loading buffer,补足水至最终体积为12µl,95℃孵育5min,随后立即冰浴放置,变性聚丙烯酰胺凝胶(15%,7M尿素)进行凝胶电泳分析。如图所示,反应进行1h需要100U的5' DNA/RNA Adenylase可以将5'端磷酸化单链DNA充分转化成腺苷酰化单链DNA;而反应进行2h则只需要50U的5' DNA/RNA Adenylase就可以将5'端磷酸化单链DNA充分转化成腺苷酰化单链DNA。

用途:制备5'端腺苷酰化的单链DNA接头,最终用于miRNA等3'端为羟基的RNA或3'端为羟基的单链DNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时,在3'端添加的接头。

来源:来源于嗜热菌的腺苷酰化酶基因在大肠杆菌中进行表达纯化而获得。

活性定义:One unit is the amount of enzyme required to catalyze the transfer of 1pmol of AMP to pDNA substrate in a total reaction volume of 20μl in 15 minutes at 65℃.

纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含核糖核酸酶。

失活或抑制:85℃加热5min可使5' DNA/RNA Adenylase失活。

反应体系为20μl时,本产品的3kU和15kU包装分别可以进行40次和200次的5'端DNA/RNA腺苷酰化反应。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R0719S-1 5' DNA/RNA Adenylase (75U/µl) 40µl
R0719S-2 10X Adenylase Reaction Buffer 100µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R0719M-1 5' DNA/RNA Adenylase (75U/µl) 200µl
R0719M-2 10X Adenylase Reaction Buffer 500µl
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少2年有效。

注意事项:

底物单链DNA或单链RNA的5'端磷酸化是必须的,3'端可以进行氨基化等封闭,也可以不封闭;不进行3'端氨基化等封闭时,建议将ATP的浓度增加至0.5mM,可以避免底物发生环化或串联反应。

5' DNA/RNA adenylase不能连接双链DNA (dsDNA)之间的缺刻。

5' DNA/RNA adenylase的最佳反应温度为65℃,并且在25℃时会出现去腺苷酰化现象,因此反应完成后推荐在85℃孵育5min以失活5' DNA/RNA adenylase。如果没有充分失活5' DNA/RNA adenylase,后续经历室温温度条件时,会导致腺苷酰化比例下降。

5' DNA/RNA adenylase使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.解冻5'端腺苷酰化修饰反应所需的各种试剂,将5' DNA/RNA adenylase置于冰上或冰盒内。
2.参考下表在冰浴中配制如下反应体系:
Reagent Volume Final Concentration
Water (DNase/RNase free) 14µl -
ssDNA or ssRNA (100µM) 1µl 5µM
10X Adenylase Reaction Buffer 2µl 1X
ATP (1mM) 2µl 0.1mM
5' DNA/RNA adenylase (75U/µl) 1µl 3.75U/µl
Total Volume 20µl -
注1:如果同时进行多个腺苷酰化反应,可以把上表中除ssDNA或ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。
注2:如果涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。如果涉及单链RNA,推荐适量添加R0102 RNase Inhibitor
3.腺苷酰化反应:65℃孵育1h。为了使连接反应更加充分,可以适当延长反应时间。
4.终止反应:85℃孵育5min以终止反应。
5.腺苷酰化产物的电泳鉴定:电泳上样前95℃孵育5min随后置于冰浴,以充分变性。尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行凝胶电泳分析。腺苷酰化修饰后分子量会变大一点(参考图1)。
6.浓缩及后续用途:可以采用常规的乙醇沉淀方法进行浓缩,后续可以使用T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl)等用于和小RNA等的3'羟基的连接反应。
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