Poly(A) Polymerase Tailing Kit
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产品编号 R7075S
数量
¥ 1210.00
产品包装:
50-250次
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碧云天生产的Poly(A) Polymerase Tailing Kit,即Poly(A)聚合酶加尾试剂盒,是一种基于E.coli Poly(A) Polymerase的活性在ATP存在的情况下将Poly(A)尾快速而有效地添加到单链RNA的3'-OH末端的试剂盒。

如果RNA分子的3’末端是磷酸,可以使用T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK),即T4多核苷酸激酶,在没有ATP存在的情况下催化去除3’端磷酸。在加Poly(A)尾之前,可以通过柱纯化(如R0028 RNAeasy™动物小RNA抽提试剂盒)或切胶回收等方法去除T4 PNK及相应的反应体系组分。

Poly(A) Polymerase Tailing Kit主要用于在RNA分子3'末端添加≥150个碱基的Poly(A)尾。Poly(A)尾的添加可提高RNA在真核细胞中的稳定性并增强其在转染或显微注射后的翻译效率。此外,Poly(A)尾还可以为合成cDNA时提供通用的引物结合位点,或用于RNA的末端标记或mRNA的定量。

碧云天Poly(A) Polymerase Tailing Kit对单链RNA添加Poly(A)尾的效果请参考图1。

图1. 碧云天Poly(A) Polymerase Tailing Kit对单链RNA添加Poly(A)尾的效果图。在100µl反应体系(50mM Tris-HCl, pH8.1, 250mM NaCl, 1mM ATP, 10mM MgCl2)中,加入人工合成的1µg 22nt的单链RNA,以及图中指定量的Poly(A) Polymerase,37℃孵育60min,65℃孵育20min终止反应。取20μl反应后的产物,加入4μl 6X DNA Loading Buffer (D0071),95℃变性3min。随后进行含7M Urea的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳。室温条件下用1X TBE作为电泳液,180V电泳90min,NA-Red (D0128) 1:1000稀释后室温染色15min,然后拍照观察。

用途:提高mRNA在真核细胞中的稳定性,提高转染或显微注射后真核细胞中RNA的翻译效率;在合成cDNA第一链时,提供引物结合位点;将放射性标记的腺苷(radiolabled adenosine)添加到RNA分子的3’末端。

本试剂盒如果用于100μl的反应体系,可以进行50次Poly(A)加尾反应;本试剂盒如果用于20μl的反应体系,可以进行250次Poly(A)加尾反应。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R7075S-1 E. coli Poly(A) Polymerase (5U/µl) 100µl
R7075S-2 10X PAP Reaction Buffer 600µl
R7075S-3 10mM ATP 600µl
R7075S-4 Nuclease-free water 1ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少两年有效。

注意事项:

反应的终止取决于加Poly(A)尾后RNA分子的后续用途。可以有多种方式终止Poly(A)加尾反应,如立即将完成的反应置于-20℃或-80℃条件下冷冻,通过有机溶剂萃取(例如苯酚/氯仿抽提)去除Poly(A) Polymerase或使用EDTA等试剂螯合Mg2+以抑制酶活性。使用本试剂盒时,不推荐对Poly(A) Polymerase进行热变性以终止反应,因为这样可能会导致RNA降解。

如果需要在体外或体内进行翻译,可以预先通过苯酚/氯仿抽提及乙醇或醋酸铵沉淀,或柱纯化已经添加了Poly(A)尾的RNA。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.参考下表在冰浴中设置反应体系。参考下表100μl反应体系中加Poly(A)尾的RNA底物量可以高达60μg,并且可根据实验需要按比例放大或缩小反应体系。在Poly(A)加尾反应中,加尾的长度取决于RNA 3’-OH末端的摩尔浓度、反应时间、酶量和ATP浓度。可以通过更改一个或多个因素来调整加尾的长度。按照如下的推荐反应体系,在37℃孵育60min,加Poly(A)尾长度可以超过150个碱基。
Reagent Volume Final Concentration
DEPC-treated Water (75.5-x)µl -
10X PAP Reaction Buffer 10µl 1X
10mM ATP 10µl 1mM
RNase Inhibitor (40U/µl) 2.5µl 1U/µl (Optional)
RNA xµl 0.01-0.6µg/µl
E. coli Poly(A) Polymerase (5U/µl) 2µl 0.1U/µl
Total Volume 100µl -
注1:由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理以去除RNase或者确保是RNase free的。
注2:用于加尾反应的RNA在使用前应进行适当的纯化,并溶解于nuclease free water中,且溶液中应不含EDTA和盐分。
注3:如果较难确保比较严格的RNase-free,推荐在上述反应体系中添加0.5µl RNase Inhibitor (R0102),以提高溶液中RNA的稳定性。
2.加尾反应:37℃孵育30-60min。
3.反应终止:反应完成后立即-20℃保存,或加入EDTA至终浓度为10mM,或者使用苯酚/氯仿抽提并使用铵盐/乙醇沉淀RNA。
4.Poly(A)加尾产物的电泳鉴定:配制与RNA分子大小相对应比例的变性琼脂糖-甲醛凝胶。使用厚度为0.75mm(或更薄)的凝胶以获得最佳的分辨率。RNA长度小于500nt时,建议使用2.5%的琼脂糖凝胶;RNA分子大于500nt时建议使用1%的琼脂糖凝胶。RNA样品75℃变性10min,用1X MOPS缓冲液,以5v/cm的电压进行凝胶电泳,直至溴酚蓝染料迁移至接近凝胶底部。电泳检测时,RNA样品中宜含有10mM或更高浓度的EDTA,否则RNA较容易出现降解。
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