碧云天生产的RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH)，即RNA 5’焦磷酸水解酶，是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台通过大肠杆菌表达、纯化获得的可用于催化5’端三磷酸化RNA (ppp-RNA)水解去除其无机焦磷酸(Inorganic pyrophosphate, PPi)而获得5’端单磷酸化RNA (p-RNA)的重组酶[1]。RppH蛋白也可以将二腺苷五磷酸(Ap₅A)分解成ADP和ATP [2]。RppH发挥活性需要Mg²⁺ [3]，其催化的反应如下所示。

ppp-RNA → p-RNA + PPi

本产品可以用于RNA的5’末端分析，5’端三磷酸化RNA配合XRN-1的剔除，以及5’端三磷酸化小RNA去焦磷酸后建库测序等。

RppH，又称NudH/YgdP，属于Nudix水解酶超家族。在细菌中，它通过控制数百个mRNA的降解而影响着细菌毒力、应激反应和DNA修复等[3]。在大肠杆菌体内，经RppH催化产生的5’端单磷酸化mRNA可被RNase E所降解[4]。在体外，经RppH催化产生的5’端单磷酸化RNA可被5’-phosphate-dependent exonuclease (XRN-1)水解为单个的核糖核苷酸[5]。

碧云天RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH)对5’端三磷酸化RNA 5’端无机焦磷酸的水解效果请参考图1。

图1. 碧云天RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH) (R7035)与国外N公司(Competitor N)的RppH对5’端三磷酸化RNA 5’端无机焦磷酸的水解效果对比图。首先，通过体外转录制备300-mer ppp-RNA底物：转录模板质粒线性化并回收，以线性化的质粒为模板，使用转录试剂盒T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit (R7016)进行体外转录，并纯化转录产物。测定300-mer ppp-RNA浓度并分装，-80ºC保存。将碧云天与N公司的RppH (5U/µl)分别稀释1.25、2.5、5、10、20、40倍，然后配制10µl反应体系：10mM Tris-HCl (pH7.9), 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 20U RNase Inhibitor (R0102), 0.5μg 300-mer ppp-RNA, 2U XRN-1 (R7040), 1μl上述不同稀释度的RppH或Storage (Dilution) Buffer，37ºC孵育30分钟，随后95ºC加热5分钟。加热结束后，每个样品中加入2µl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，全部上样，160V电泳6分钟。碧云天的RppH与N公司的产品相比，对5’端三磷酸化RNA 5’端无机焦磷酸具有基本一致的水解效果。图中数据仅供参考，不同实验条件下获得的数据会有一定的差异。

来源：由大肠杆菌表达，表达基因为大肠杆菌的RppH基因。

分子量：约19.7kDa。

活性定义：One unit is the amount of enzyme that converts 1µg 300 mer RNA transcript into a XRN-1 digestible RNA in 30 minutes at 37ºC。

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。

Storage (Dilution) Buffer: 20mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.01% Triton X-100 and 50% Glycerol.

10X Reaction Buffer: 100mM Tris-HCl (pH7.9), 500mM NaCl, 100mM MgCl₂, 10mM DTT.

失活或抑制：氟离子会对RppH的活性造成抑制。此外，核苷酸和警报酮(Alarmones)也会抑制RppH的活性[4]。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R7035S-1	RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH) (5U/μl)	40μl
R7035S-2	10X Reaction Buffer	1ml
R7035S-3	Storage (Dilution) Buffer	1ml
-	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
R7035M-1	RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH) (5U/μl)	200μl
R7035M-2	10X Reaction Buffer	5ml
R7035M-3	Storage (Dilution) Buffer	5ml
-	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，至少两年有效。

注意事项：

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 体外转录，获取RppH作用底物。
a. 转录模板质粒线性化，并回收线性化质粒。
b. 以线性化的质粒为模板，使用转录试剂盒T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit (R7016)进行体外转录，并纯化转录产物。测定RNA浓度并分装，-80ºC保存。
2. 转录产物的酶解。
a. 参考下表，选择适当的稀释倍数，用Storage (Dilution) Buffer对RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH) (5U/μl)进行稀释。

Dilution Ratio	RppH Concentration
1.25	4U/μl
2.5	2U/μl
5	1U/μl
10	0.5U/μl
20	0.25U/μl
40	0.125U/μl

b. 对于体外转录产物的水解，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。

Reagent	Control		Sample
	Volume	Conc. or amount	Volume	Conc. or amount
Ultrapure Water	4.5μl	-	4.5μl	-
10X Reaction Buffer	1μl	1X	1μl	1X
RNase Inhibitor (40U/μl)	0.5μl	20U	0.5μl	20U
pppRNA (0.5μg/μl)	1μl	0.5μg	1μl	0.5μg
Storage (Dilution) Buffer	1μl	-	-	-
RppH (Diluted)	-	-	1μl	0.125-4U
XRN-1 (1U/μl)	2μl	2U	2μl	2U
Total volume	10μl	-	10μl	-

注：Ultrapure Water推荐使用碧云天的ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。RNase Inhibitor推荐使用碧云天的R0102；XRN-1推荐使用碧云天的R7040。
c. 反应条件：37ºC孵育30分钟。
d. 95ºC加热5分钟，每个样品中加入2µl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，全部上样，160V电泳6分钟。
参考文献：
1. Deana A, Celesnik H, Belasco JG. Nature. 2008. 451:355-358.
2. Bessman MJ, Walsh JD, Dunn CA, Swaminathan J, Weldon JE, Shen J. J Biol Chem. 2001. 12;276(41):37834-8.
3. Vasilyev N, Serganov A. J Biol Chem. 2015. 290(15):9487-99.
4. Gao A, Vasilyev N, Kaushik A, Duan W, Serganov A. Nucleic Acids Res. 2020. 48(7):3776-3788.
5. Stevens A. J Biol Chem. 1980. 255(7):3080-5.
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D2314-100μg	pRNA-SP6-T7 (RNA体外转录质粒)	100μg
D6128S	BsaI	1kU
D6128M	BsaI	5kU
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D6128XL	BsaI	200kU
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D7385-500μl	NTP Mix (10mM each, Nuclease free)	500μl
D7385-2ml	NTP Mix (10mM each, Nuclease free)	2ml
D7387-250μl	NTP Mix (25mM each, Nuclease free)	250μl
D7387-1ml	NTP Mix (25mM each, Nuclease free)	1ml
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R0022	DEPC水(DNase、RNase free)	500ml
R0081-1ml	BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads (RNA纯化磁珠)	1ml
R0081-5ml	BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads (RNA纯化磁珠)	5ml
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R0102-2kU	RNase Inhibitor	2000U
R0102-10kU	RNase Inhibitor	10000U
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