RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH)
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产品编号 R7035M
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¥ 1758.00
产品包装:
200U 1kU
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碧云天生产的RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH),即RNA 5’焦磷酸水解酶,是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台通过大肠杆菌表达、纯化获得的可用于催化5’端三磷酸化RNA (ppp-RNA)水解去除其无机焦磷酸(Inorganic pyrophosphate, PPi)而获得5’端单磷酸化RNA (p-RNA)的重组酶[1]。RppH蛋白也可以将二腺苷五磷酸(Ap5A)分解成ADP和ATP [2]。RppH发挥活性需要Mg2+ [3],其催化的反应如下所示。

ppp-RNA → p-RNA + PPi

本产品可以用于RNA的5’末端分析,5’端三磷酸化RNA配合XRN-1的剔除,以及5’端三磷酸化小RNA去焦磷酸后建库测序等。

RppH,又称NudH/YgdP,属于Nudix水解酶超家族。在细菌中,它通过控制数百个mRNA的降解而影响着细菌毒力、应激反应和DNA修复等[3]。在大肠杆菌体内,经RppH催化产生的5’端单磷酸化mRNA可被RNase E所降解[4]。在体外,经RppH催化产生的5’端单磷酸化RNA可被5’-phosphate-dependent exonuclease (XRN-1)水解为单个的核糖核苷酸[5]。

碧云天RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH)对5’端三磷酸化RNA 5’端无机焦磷酸的水解效果请参考图1。

图1. 碧云天RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH) (R7035)与国外N公司(Competitor N)的RppH对5’端三磷酸化RNA 5’端无机焦磷酸的水解效果对比图。首先,通过体外转录制备300-mer ppp-RNA底物:转录模板质粒线性化并回收,以线性化的质粒为模板,使用转录试剂盒T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit (R7016)进行体外转录,并纯化转录产物。测定300-mer ppp-RNA浓度并分装,-80ºC保存。将碧云天与N公司的RppH (5U/µl)分别稀释1.25、2.5、5、10、20、40倍,然后配制10µl反应体系:10mM Tris-HCl (pH7.9), 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 20U RNase Inhibitor (R0102), 0.5μg 300-mer ppp-RNA, 2U XRN-1 (R7040), 1μl上述不同稀释度的RppH或Storage (Dilution) Buffer,37ºC孵育30分钟,随后95ºC加热5分钟。加热结束后,每个样品中加入2µl DNA上样缓冲液(6X) (D0071),进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,全部上样,160V电泳6分钟。碧云天的RppH与N公司的产品相比,对5’端三磷酸化RNA 5’端无机焦磷酸具有基本一致的水解效果。图中数据仅供参考,不同实验条件下获得的数据会有一定的差异。

来源:由大肠杆菌表达,表达基因为大肠杆菌的RppH基因。

分子量:约19.7kDa。

活性定义:One unit is the amount of enzyme that converts 1µg 300 mer RNA transcript into a XRN-1 digestible RNA in 30 minutes at 37ºC。

纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶。

Storage (Dilution) Buffer: 20mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.01% Triton X-100 and 50% Glycerol.

10X Reaction Buffer: 100mM Tris-HCl (pH7.9), 500mM NaCl, 100mM MgCl2, 10mM DTT.

失活或抑制:氟离子会对RppH的活性造成抑制。此外,核苷酸和警报酮(Alarmones)也会抑制RppH的活性[4]。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R7035S-1 RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH) (5U/μl) 40μl
R7035S-2 10X Reaction Buffer 1ml
R7035S-3 Storage (Dilution) Buffer 1ml
- 说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7035M-1 RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH) (5U/μl) 200μl
R7035M-2 10X Reaction Buffer 5ml
R7035M-3 Storage (Dilution) Buffer 5ml
- 说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,至少两年有效。

注意事项:

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 体外转录,获取RppH作用底物。
a. 转录模板质粒线性化,并回收线性化质粒。
b. 以线性化的质粒为模板,使用转录试剂盒T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit (R7016)进行体外转录,并纯化转录产物。测定RNA浓度并分装,-80ºC保存。
2. 转录产物的酶解。
a. 参考下表,选择适当的稀释倍数,用Storage (Dilution) Buffer对RNA 5’ Pyrophosphohydrolase (RppH) (5U/μl)进行稀释。
Dilution Ratio RppH Concentration
1.25 4U/μl
2.5 2U/μl
5 1U/μl
10 0.5U/μl
20 0.25U/μl
40 0.125U/μl
b. 对于体外转录产物的水解,参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
Reagent Control Sample
Volume Conc. or amount Volume Conc. or amount
Ultrapure Water 4.5μl - 4.5μl -
10X Reaction Buffer 1μl 1X 1μl 1X
RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl 20U 0.5μl 20U
pppRNA (0.5μg/μl) 1μl 0.5μg 1μl 0.5μg
Storage (Dilution) Buffer 1μl - - -
RppH (Diluted) - - 1μl 0.125-4U
XRN-1 (1U/μl) 2μl 2U 2μl 2U
Total volume 10μl - 10μl -
注:Ultrapure Water推荐使用碧云天的ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。RNase Inhibitor推荐使用碧云天的R0102;XRN-1推荐使用碧云天的R7040
c. 反应条件:37ºC孵育30分钟。
d. 95ºC加热5分钟,每个样品中加入2µl DNA上样缓冲液(6X) (D0071),进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,全部上样,160V电泳6分钟。
参考文献:
1. Deana A, Celesnik H, Belasco JG. Nature. 2008. 451:355-358.
2. Bessman MJ, Walsh JD, Dunn CA, Swaminathan J, Weldon JE, Shen J. J Biol Chem. 2001. 12;276(41):37834-8.
3. Vasilyev N, Serganov A. J Biol Chem. 2015. 290(15):9487-99.
4. Gao A, Vasilyev N, Kaushik A, Duan W, Serganov A. Nucleic Acids Res. 2020. 48(7):3776-3788.
5. Stevens A. J Biol Chem. 1980. 255(7):3080-5.
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