碧云天生产的Universal miRNA Cloning Linker (5´腺苷化3´封闭)，即通用miRNA克隆接头(5´腺苷化3´封闭)或Universal miRNA Cloning Linker (5'adenylated, 3'blocked)，是一种常用于miRNA等3'端为羟基的RNA或3'端为羟基的单链DNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时，在3'端添加的接头。

本产品5´端腺苷酰化(也称5´端预腺苷酰化或5´端预腺苷化，5′ pre-adenylated或5′ pre-adenylation)，3´端氨基封闭，可以用于3'端为羟基的RNA的3'端接头的添加。RNA连接酶可以识别“活化”的5´端腺苷酰化的本产品，在无需ATP存在的条件下，可将本产品的5´端与另外一条单链寡核苷酸的3´端羟基共价连接。利用5´端腺苷酰化，3´端封闭的本产品，加入RNA连接酶，在无需添加ATP的条件下，就能实现本产品5'端和目标序列3'羟基的特异性共价连接。例如和miRNA连接时，可以有效避免miRNA的自连、不同miRNA之间的连接、本产品的自连或本产品不同链之间的连接，而仅发生本产品5'端和miRNA 3'羟基之间的特异性连接。

本产品的电泳图和连接效果图请参考图1。图中可见，本产品条带清晰，纯度高，与5'端为磷酸化的序列相比有显著的电泳迁移率差异(图1A)；并且本产品使用T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl2), truncated与ssRNA连接时，连接效率非常高(图1B)。

图1. Universal miRNA Cloning Linker Linker (5´腺苷化3´封闭)及其连接效果图图。图A. 本产品5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´ (AppDNA)与5´-pCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´ (pDNA)的电泳对比图。图B. 本产品(AppDNA)与ssRNA使用T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl2), truncated的连接效果图。图中可见本产品与ssRNA有非常高的连接效率。

本产品的寡核苷酸序列是：5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´。本产品的序列同NEB公司的S1315S Universal miRNA Cloning Linker。

本产品以水溶液的形式存在，浓度为40ng/µl，即6.9µM。

用途：本产品可以应用于小RNA克隆、miRNA文库构建。

本产品的1µg小包装约通常可以进行8-17次连接反应，5µg中包装约通常可以进行40-85次连接反应。具体的连接反应次数和反应体系的体积和本产品的用量有关。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R0702S	Universal miRNA Cloning Linker (40ng/µl)	1µg
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
R0702M	Universal miRNA Cloning Linker (40ng/µl)	5µg
—	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存，一年有效。-80℃保存，至少一年有效。

注意事项：

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.使用本产品与ssRNA的3'羟基末端连接推荐使用T4 TNA Ligase 2, truncated。也可以使用T4 TNA Ligase 2, truncated,K227Q，或T4 TNA Ligase 2, truncated,T4 TNA Ligase 2, truncatedKQ (R55K, K227Q)。
2.参考下表在冰浴中配制如下反应体系：

Reagent	Volume	Final Concentration
ssRNA	xµl	0.5µM
DEPC-treated Water	(1.1 or 2.55)-xµl	-
Universal miRNA Cloning Linker (6.9pmol/µl)	2.9 or 1.45µl	1 or 0.5µM
PEG8000 (50%, RNase Free)	12µl	0.3
10X Reaction Buffer	2µl	1 X
RNase Inhibitor (40U/μl)	1µl	2U/μl
T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl)	1µl	10U/µl -
Total Volume	20µl	-

注意：
a.由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DECP处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase Inhibitor，以避免ssRNA或其连接产物的降解，尽管经测试我们发现在严格操作的情况下，不加RNase Inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
b.进行连接反应时，如果样品RNA比较珍贵，希望充分被连接，可以按照接头和样品RNA的摩尔比为2:1的比例进行连接；如果样品RNA比较充裕，同时感觉本产品的成本偏高时，可以按照接头和样品RNA的摩尔比摩尔比1:1甚至1:2的比例进行连接反应，这样可以很好地节省本产品。
c.如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
3.连接反应：25℃, 孵育60min。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
4.终止反应：65℃，孵育15min。

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