碧云天研发生产的小RNA 3'接头(5'腺苷化, 3'封闭)及连接试剂盒(Small RNA 3'-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)，是一种提供了5'腺苷化和3'封闭的Universal miRNA Cloning Linker及相应的连接酶和配套试剂，用于miRNA等3'端为羟基的小RNA和接头连接的试剂盒。3'端连接了接头的小RNA后续可以用于其克隆、高通量测序建库或PCR检测等。

本试剂盒也可以用于3'端为羟基的单链DNA和接头的连接，因此也可以称为单链DNA 3'接头(5'腺苷化, 3'封闭)及连接试剂盒(ssDNA 3'-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)，或核酸3'接头(5'腺苷化, 3'封闭)及连接试剂盒(3'-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)。

本试剂盒提供的Universal miRNA Cloning Linker，其5´端腺苷酰化(也称5'端预腺苷酰化或5'端预腺苷化，5'pre-adenylated或5'pre-adenylation)，3'端氨基封闭，可以用于3'端为羟基的RNA的3'端接头的添加。本试剂盒中提供的T4 RNA Ligase2, truncated可以识别“活化”的5´端腺苷酰化的Universal miRNA Cloning Linker，在无需ATP存在的条件下，可将Universal miRNA Cloning Linker的5´端与另外一条单链寡核苷酸的3´端羟基共价连接。

使用本试剂盒和miRNA连接时，可以有效避免miRNA的自连、不同miRNA之间的连接、Linker的环化或Linker分子之间的连接，而仅发生Linker 5'端和miRNA 3'羟基之间的特异性连接。

本试剂盒催化连接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效果请参见图1。

图1. 碧云天生产的小RNA 3'接头(5'腺苷化, 3'封闭)及连接试剂盒催化连接Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)和ssRNA的效果图。反应体系为20μl，Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)的终浓度为1μM，单链RNA的终浓度为0.5μM，反应条件为25℃孵育60min，反应完毕后立即取样在65℃孵育20min终止反应，加入变性上样缓冲液并在95℃孵育5min后放至冰浴中，随后用15%尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，本试剂盒催化连接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效率非常高。

本试剂盒提供的Universal miRNA Cloning Linker的序列是：5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´。该序列同NEB公司的S1315S Universal miRNA Cloning Linker。

本试剂盒如果用于20µl的反应体系，并按照本试剂盒推荐的连接体系，可以用于20次的Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的连接反应。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R0700S-1	Universal miRNA Cloning Linker (6.9µM)	29µl
R0700S-2	DEPC-treated Water	100µl
R0700S-3	PEG8000 (50%, RNase Free)	300µl
R0700S-4	RNase Inhibitor (40U/μl)	20µl
R0700S-5	T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl)	20µl
R0700S-6	10X T4Rnl2, truncated Buffer	50µl
—	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存，至少一年有效。

注意事项：

本试剂盒附带提供的试剂均用DEPC水配制，可直接用于底物为单链RNA (3'端需为羟基)和Universal miRNA Cloning Linker (5′ adenylated, 3′ blocked) 的连接反应。

使用本试剂盒连接ssRNA和Universal miRNA Cloning Linker (5′ adenylated, 3′ blocked)时，建议使用的PEG8000的浓度为10% -30%，适当提高PEG8000的浓度，会显著提高连接效率。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.用于连接Universal miRNA Cloning Linker和单链RNA (ssRNA)的3'羟基末端时，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：

Reagent	Volume	Final Concentration
ssRNA	xµl	0.5µM
DEPC-treated Water	2.55-xµl	-
Universal miRNA Cloning Linker (6.9µM)	1.45µl	0.5µM
PEG8000 (50%, RNase Free)	12µl	0.3
10X T4 Rnl2, truncated Buffer	2µl	1 X
RNase Inhibitor (40U/μl)	1µl	2U/μl
T4 RNA Ligase2, truncated	1µl	-
Total Volume	20µl	-

注意：
a.由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase inhibitor，以避免ssRNA或其连接产物的降解，尽管经测试我们发现在严格操作的情况下，不加RNase inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
b.进行连接反应时，通常推荐ssRNA和linker按照1:1进行连接反应，以适当节约本试剂盒。如果样品RNA比较珍贵，希望充分被连接，可以按照接头和样品RNA的摩尔比为2:1的比例进行连接；如果样品RNA比较充裕，同时感觉本试剂盒的成本偏高时，可以按照接头和样品RNA的摩尔比摩尔比1:1甚至1:2的比例进行连接反应，这样可以很好地节省本试剂盒。
c.如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
2.连接反应：25℃, 孵育60min。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
3.终止反应：65℃，孵育20min。

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