5' DNA Adenylation Kit
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产品编号 R0716M
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¥ 1345.00
产品包装:
10次 50次
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碧云天生产的5'DNA Adenylation Kit,即5'DNA腺苷酰化试剂盒,是一种非常便捷和高效的通过酶学方法将单链DNA (ssDNA) 5'端腺苷酰化修饰的试剂盒。

本试剂盒制备产生的5'端腺苷酰化修饰的单链DNA,常用于miRNA等3'端为羟基的RNA或3'端为羟基的单链DNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时,在3'端添加的接头。

本试剂盒进行腺苷酰化修饰反应时,需要腺苷酰化酶(Adenylase)、ATP和待腺苷酰化修饰的5’端磷酸化的单链DNA。

本试剂盒腺苷酰化修饰效率高,通常可以达到95%以上。对5'端磷酸化的单链DNA进行腺苷酰化修饰反应时,无论该单链DNA的3'端是否进行了氨基化等封闭都可以得到高产量的腺苷酰化产物。通常本试剂盒能将95%以上的5'端磷酸化的DNA (pDNA)转化成腺苷酰化DNA (AppDNA),因此腺苷酰化的产物通常不需要进行电泳切胶回收,可以直接通常乙醇沉淀进行进一步浓缩后用于后续的连接反应。

本产品以5'端磷酸化的单链DNA为底物,腺苷酰化酶将ATP分解成AMP和PPi,AMP转移到单链DNA的5'磷酸基团上,形成腺苷酰化单链DNA,从而制备出腺苷酰化接头(linker)。

本试剂盒催化5'端磷酸化单链DNA生成5'端腺苷酰化修饰单链DNA的效果参见图1。

图1. 使用碧云天生产的5'DNA Adenylation Kit制备5'端腺苷酰化修饰单链DNA的效果图。反应体系为20μl,单链DNA的终浓度为5μM,反应条件为65ºC分别孵育15、30、45、60和90min,反应完毕后85℃孵育5min终止反应。电泳上样前95℃孵育5min随后置于冰浴以充分变性,尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行凝胶电泳分析。如图所示,本试剂盒在15min内就可以将大部分5'端磷酸化单链DNA (pDNA)催化生成腺苷酰化的单链DNA (AppDNA),孵育60min可以确保将95%以上的底物转化成腺苷酰化修饰的单链DNA。

本产品也可以用于5'端磷酸化的单链RNA的5'端腺苷酰化修饰,可根据具体应用选择合适的实验步骤,同时需要额外准备R0102 RNase InhibitorR0021 DEPC水等。

本产品包含的Adenylase来源为嗜热古细菌,在大肠杆菌中进行表达而获得。

优点:单步反应即可完成5'端磷酸化修饰的单链DNA或RNA的腺苷酰化修饰,与传统的化学方法相比较,更加简便;对于底物转化效率高达95%以上,无需切胶纯化仅需酒精沉淀等即可用于后续反应;在65℃这样一个较高的温度反应,可以有效避免二级结构对于5'端腺苷酰化修饰反应的干扰;适用于pmol级别底物量的反应体系,也可以很方便地放大至µmol级别底物量的反应体系。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R0716S-1 Adenylase 20µl
R0716S-2 10X Adenylation Reaction Buffer 25µl
R0716S-3 ATP (1mM) 25µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R0716M-1 Adenylase 100µl
R0716M-2 10X Adenylation Reaction Buffer 125µl
R0716M-3 ATP (1mM) 125µl
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事项:

底物单链DNA或单链RNA的5'端磷酸化是必须的,3'端可以进行氨基化等封闭,也可以不封闭。

本试剂盒提供的腺苷酰化反应体系可以按比例放大反应体系,对腺苷酰化产物的得率无显著影响。

本试剂盒提供的Adenylase的最佳反应温度为65℃,并且在25℃时会出现去腺苷酰化现象,因此反应完成后推荐在85℃孵育5min以失活Adenylase。如果没有失活Adenylase,后续经历室温温度条件时,会导致腺苷酰化比率下降。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:

磷酸化的ssDNA序列 5'端腺苷酰化:

1.解冻5'端腺苷酰化修饰反应所需的各种试剂,将Adenylase置于冰浴上或冰盒内。

2.参考下表在冰浴中配制如下反应体系:

Reagent Volume Final Concentration
Water (DNase free or DEPC-treated) 13µl -
ssDNA or ssRNA (100µM) 1µl 5µM
10X Adenylation Reaction Buffer 2µl 1X
ATP (1mM) 2µl 0.1mM
Adenylase 2µl -
Total Volume 20µl -
注意:
a.如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。
b.如果涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DECP处理去除RNase或者确保是RNase free的。如果涉及单链RNA,推荐适量添加R0102 RNase Inhibitor
3.腺苷酰化反应:65℃孵育1h。个别情况为了使连接反应更加充分,可以适当延长反应时间。
4.终止反应:85℃孵育5min。
5.腺苷酰化产物的电泳鉴定:电泳上样前95℃孵育5min随后置于冰浴,以充分变性。尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行凝胶电泳分析。腺苷酰化修饰后分子量会变大一点(参考图1)。
6.浓缩及后续用途:可以采用常规的乙醇沉淀方法进行浓缩,后续可以使用T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl)等用于和小RNA等的3'羟基的连接反应。
常见问题:
1.腺苷酰化反应不完全或反应产物非常少。
a.用于制备腺苷酰化接头时出现反应不完全的情况,建议可适当延长反应时间至2h甚至过夜。
b.在不改变底物量的前提下适当增加酶量,或在不改变酶量的前提下适当减少底物量。
c.当底物为ssRNA时,可能会出现ssRNA降解的情况,建议使用RNase Free的水及耗材。
d.电泳条带不清晰或弥散,建议用尿素(7M)变性聚丙烯酰胺 (15%)凝胶;当底物为ssDNA时,建议电泳条件为180V,50-60min;当底物为ssRNA时,建议电泳条件为50-60V,20-30min;若上样前用电泳液冲洗上样孔中的尿素,会得到更理想的电泳条带。
e.放大体系在65℃水浴锅中进行反应时,反应进行1h或更长时间时,会明显观察到有白色沉淀出现,这是Adenylase沉淀所致,这时通常底物已反应完全,所以酶的析出不会对产物的得率产生显著影响。
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使用本产品的文献: