T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)
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产品编号 R0621M
数量
¥ 1036.00
产品包装:
1000U 5000U
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碧云天生产的T4 RNA Ligase 1,即T4 RNA连接酶1,是一种ATP-依赖的可以催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸分子间或分子内5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键的酶。T4 RNA Ligase 1对于RNA之间的连接效率最高,DNA与RNA之间的连接效率次之,而DNA之间的连接效率最低,因此也被认为是一种ssRNA ligase。

T4 RNA Ligase 1主要用于RNA和RNA之间的连接,连接时需要5'磷酸基团和3'羟基的存在。

T4 RNA Ligase 1也可以用于RNA和单核苷酸之间的连接,单核苷酸必须为5'和3'均磷酸化的形式,此时常用于RNA的3'末端标记。

T4 RNA Ligase 1也可以用于DNA和RNA之间的连接。当DNA提供5'磷酸基团,RNA提供3'羟基时,连接效率较高;当DNA提供3'羟基,RNA提供5'磷酸基团时,连接效率非常低。

T4 RNA Ligase也可以用于DNA和DNA之间的连接,但连接效率非常低。主要用于DNA的环化连接,例如5' RACE中的cDNA环化。DNA和DNA之间的连接尽管可以进行,但比较困难。

T4 RNA Ligase 1催化连接反应过程如下。首先,T4 RNA Ligase 1与ATP发生反应,产生中间产物T4 RNA Ligase 1-AMP,并释放焦磷酸;接着,AMP从中间产物T4 RNA Ligase 1-AMP中转移至核酸的5'磷酸末端,形成腺苷酰化核酸中间产物;最后,在T4 RNA Ligase 1的催化下,另一核酸的3'羟基进攻腺苷酰化核酸中间产物的5'磷酸末端,形成3'-5'磷酸二酯键,并释放出AMP。

用途:ssRNA的分子间连接;ssRNA与ssDNA的分子间连接;也可以用于ssDNA分之间连接,但效率较低;ssRNA 3′-OH末端用放射性同位素5'-[32P]pCp等的标记;单链Oligo RNA及Oligo DNA的合成;tRNA的特别修饰;在5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)实验中,用于寡核苷酸连接到单链cDNA中;在蛋白质中引入非天然氨基酸等。

来源:大肠杆菌表达的重组蛋白,表达基因的来源为T4嗜菌体,该酶分子量约为44kDa。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme required to convert 1 nanomole of 5´-[32P]rA16 into a phosphatase-resistant form in 30 minutes at 37℃。

纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶,不含磷酸酯酶。

酶储存溶液:10mM Tris (pH7.5), 200mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50%(v/v) Glycerol。

10X Reaction Buffer:500 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 25℃), 100 mM MgCl2, 20 mM DTT。

失活或抑制:65℃加热15min或煮沸2min可使T4 RNA Ligase 1失活。或加入10%体积的0.5M EDTA pH8.0也可以终止反应。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R0621S-1 T4 RNA Ligase 1 (10U/µl) 100µl
R0621S-2 10X Reaction Buffer 300µl
R0621S-3 ATP (10mM) 200µl
R0621S-4 PEG8000 (50%, RNase free) 500µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R0621M-1 T4 RNA Ligase 1 (10U/µl) 500µl
R0621M-2 10X Reaction Buffer 1.5ml
R0621M-3 ATP (10mM) 1ml
R0621M-4 PEG8000 (50%, RNase free) 1.5ml×2
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事项:

本产品连接的底物无论是单链RNA还是单链DNA,都需要确保5'末端磷酸化或腺苷酰化,同时3'末端是羟基。

如果连接底物为双链RNA或DNA,推荐使用碧云天生产的R0632 T4 RNA Ligase 2等系列产品。

可根据具体应用选择合适的操作方法,可能需准备额外的试剂,如RNase inhibitorDEPC水等。

根据连接反应的类型,推荐在反应体系中加入适量的PEG8000。建议连接单链RNA或DNA的分之间连接反应体系中PEG8000的终浓度为15%-25%,这样可以显著提高酶活性,同时不影响反应特性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.对于单链RNA的环化连接反应,参考下表在冰浴中配制如下反应体系:
Reagent Volume Final Concentration
DEPC-treated Water 15.5µl -
ssRNA (20µM) 0.5µl 0.5µM
10X T4 Rnl1 Reaction Buffer 2µl 1X
ATP (1mM) 1µl 50µM
T4 RNA Ligase 1 (10U/µl) 1µl 0.5U/µl
Total Volume 20µl -
注意:
a.由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA,可以考虑适量添加R0102 RNase Inhibitor,尽管我们实测不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。
b.上述表格中ssRNA的用量已经比较大,对于样品比较少的情况下,完全可以大幅减少ssRNA的用量的。
c.如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。
d.本产品提供的ATP的浓度为10mM,而用于环化连接反应的ATP浓度为1mM,建议根据具体实验条件进行适当的稀释。
2.对于单链RNA或DNA的分子间连接反应,参考下表在冰浴中配制如下反应体系:
Reagent Volume Final Concentration
DEPC-treated Water 7.5µl -
ssRNA (20µM) 0.5µl 0.5µM
10X T4 Rnl1 Reaction Buffer 2µl 1X
ATP (10mM) 1µl 0.5mM
PEG8000 (50%) 8µl 0.2
T4 RNA Ligase 1 (10U/µl) 1µl 0.5U/µl
Total Volume 20µl -
注意:
a.由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA,可以考虑适量添加R0102 RNase Inhibitor,尽管我们实测不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。
b.上述表格中ssRNA的用量已经比较大,对于样品比较少的情况下,完全可以大幅减少ssRNA的用量的。
c.如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。
d.PEG8000的终浓度可以在15%-25%范围内根据连接效果适当调节。
e.用于分子之间的连接,通常提供5'磷酸的核酸3'羟基需要被封闭(例如氨基修饰),提供3'羟基的核酸5'端需要被封闭(例如5'端为羟基)。如果提供3'羟基的核酸的量有所不足,提供5'磷酸的核酸的用量可以是提供3'羟基的核酸的2倍左右。
3.连接反应:37℃孵育30min。如果发现效果欠佳可以尝试25℃孵育2h或16℃孵育16h。为了使连接反应更加充分,可以适当延长连接反应时间。
4.终止反应:65℃孵育15min或煮沸2min,即可终止反应。
使用本产品的文献: