pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla
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产品编号 D2819-1μg
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1μg 100μg
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pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和灭瘟素S (Blasticidin S)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达,同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP,便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和灭瘟素S (Blasticidin S)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用Blasticidin S (ST018)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
P2A 1769-1834
EGFP 1835-2551
Myc 2558-2587
T7 promoter 2642-2660
SV40 poly(A) signal 2934-3055
f1 ori 3062-3517
AmpR promoter 3544-3648
SV40 promoter 3650-4007
SV40 ori 3858-3993
BSD 4042-4440
HSV TK poly(A) signal 4672-4719
ori 5048-5636

pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla质粒(5744bp)的图谱如下:

pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2819 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla.pdf

pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII AccB7I AcvI AfeI AflII
AgeI AhlI Aor13HI Aor51HI AscI AsiGI AsiSI
AspI BaeI BbeI BbrPI BbvCI BcuI BfrI
BoxI BseAI BsePI BshTI BsiWI Bsp13I BspEI
BspQI BspTI BssHII BssNAI Bst98I Bst1107I BstAFI
BstEII BstENI BstPI BstPAI BstZ17I CpoI CspI
CspAI DinI Eco47III Eco72I Eco91I EcoNI EcoO65I
EgeI EheI FseI FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI
KasI Kpn2I LguI MauBI Mly113I MreI MroI
MspCI MssI NarI PalAI PauI PciSI Pfl23II
PflFI PflMI PI-PspI PI-SceI PinAI PluTI PmaCI
PmeI PmlI PshAI PspCI PspEI PspLI PspXI
PsrI PsyI RgaI RigI RsrII Rsr2I SanDI
SapI SbfI SdaI SfaAI SfoI SgfI SgrAI
SgrDI SgsI SmiI SpeI Sse8387I SspDI SwaI

pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 1752 MfeI C`AATT,G 2920
AhdI GACNN,N`NNGTC 136 MluI A`CGCG,T 3056
ApaI G,GGCC`C 2595 MscI TGG|CCA 4045
BamHI G`GATC,C 1721 NdeI CA`TA,TG 1274
BbsI GAAGACNN`NNNN, 4127 NheI G`CTAG,C 1631
BclI T`GATC,A 2827 NotI GC`GGCC,GC 1702
BfuAI ACCTGCNNNN`NNNN, 4492 NruI TCG|CGA 4273
BglII A`GATC,T 1757 PaeR7I C`TCGA,G 1763
BlpI GC`TNA,GC 4437 PciI A`CATG,T 5692
BmgBI CAC|GTC 1813 PpuMI RG`GWC,CY 4201
BmtI G,CTAG`C 1635 PspOMI G`GGCC,C 2591
BsaXI ,NNN`(N)9ACNNNNNCTCCNNNNNNN,NNN` 3220 PstI C,TGCA`G 1737
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 1803 SacI G,AGCT`C 1689
BspDI AT`CG,AT 4010 SacII CC,GC`GG 1696
BspMI ACCTGCNNNN`NNNN, 4492 SalI G`TCGA,C 1751
BsrGI T`GTAC,A 2544 ScaI AGT|ACT 616
BstBI TT`CG,AA 4456 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3945
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 1697 SmaI CCC|GGG 1716
ClaI AT`CG,AT 4010 SnaBI TAC|GTA 1380
DraIII CAC,NNN`GTG 3286 SrfI GCCC|GGGC 1716
Eco53kI GAG|CTC 1687 StuI AGG|CCT 3991
EcoRI G`AATT,C 1739 TspMI C`CCGG,G 1714
EcoRV GAT|ATC 1747 XbaI T`CTAG,A 2552
Esp3I CGTCTCN`NNNN, 1803 XhoI C`TCGA,G 1763
HindIII A`AGCT,T 1727 XmaI C`CCGG,G 1714
HpaI GTT|AAC 2933 XmnI GAANN|NNTTC 735

pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物EGFP primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

EGFP primer (1837-1853): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla的全序列信息:D2819 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2819-1µg pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla 1µg
D2819-100µg pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla 100µg
说明书 1份
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-MCS-P2A-EGFP-Myc-Bla质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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ST018-5ml Blasticidin S HCl (灭瘟素S) 10mg/ml×5ml
C0533-0.5ml Lipo8000™转染试剂 0.5ml
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C0533-7.5ml Lipo8000™转染试剂 7.5ml
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D2723 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2734 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2738 pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2757 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
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D2796 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2797 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2798 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg 1µg/100µg
D2799 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2801 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
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D2808 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
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