pCMV-EGFP-p65
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产品编号 D2820-100μg
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¥ 1169.00
产品包装:
1μg 100μg
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pCMV-EGFP-p65是碧云天自行研发生产的在哺乳动物细胞中表达EGFP标签的p65融合蛋白的质粒。该质粒含有CMV启动子,带有卡那霉素(Kanamycin)抗性,可以使用G418 (ST081)筛选稳定表达融合蛋白的细胞株,是研究NF-κB信号通路的激活和抑制的有效工具。本产品主要适合用于通过荧光显微镜等活细胞观察NF-κB的核转运激活。

NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells),中文名为激活的B细胞核因子kappa-轻链增强子,是细胞内重要的核转录因子,参与细胞对外界刺激的响应、炎症反应、免疫应答等过程,几乎存在于所有类型的动物细胞中。NF-κΒ作为转录因子蛋白家族,包括5个亚单位:p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (REL-associated protein, Rel-A)、Rel-B和c-Rel,它们的N端都具有高度保守的RHD (REL homology domain);5个亚单位根据C端结构域的不同被分为两类,第一类为p50、p52,其C端具有ankyrin重复结构域具有转录抑制活性(Transrepression activity)和招募IKK (Inhibitory κB kinase)的致死结构域(Dead domain);第二类为p65、Rel-B和c-Rel,其C端具有转录所必需的转录激活结构域(Transactivation domain, TAD)[1]。

NF-κB在静息状态或失活状态(Resting state or inactive state)下,其高度保守的RHD中的核定位信号(Nuclear localization sequence, NLS)与抑制因子IκB (Inhibitor of NF-κB)结合形成非活性复合物,NF-κB以失活状态存在于细胞质中。虽然IκB蛋白掩盖了p65的NLS信号,但没有掩盖p50的NLS信号,因此静息状态下NF-κB可以持续在细胞核和细胞质之间穿梭(Shuttle)维持很低水平的活性[2]。

NF-κB的激活存在两条途径,即经典途径和非经典途径。经典途径:在受到促炎信号(如炎症细胞因子TNF-α、IL-1、病原体和病毒双链RNA等)的刺激后,使细胞中的IKK复合物被招募并激活,IKK复合物由IKKα和/或IKKβ催化亚基以及NEMO (NF-κB Essential Modulator,亦称IKKγ)组成,IKK复合物使IκB被磷酸化,磷酸化的IκB随后发生泛素化被蛋白酶体降解,使得NF-κB的核定位信号暴露从而进入细胞核激活靶基因;非经典途径:该途径由NF-κB抑制激酶NIK (NF-κB inhibitory kinase)介导,NIK磷酸化并激活IKK的亚基IKKα,磷酸化的IKKα再使p100磷酸化,导致加工和释放有活性的p52和RelB异源二聚体转移至细胞核并激活靶标基因,这一过程发生在淋巴器官发育期间,淋巴器官负责产生B淋巴细胞和T淋巴细胞[2]。

pCMV-EGFP-p65转染细胞后通过荧光显微镜观察,静息状态下EGFP-p65均匀的分布在细胞质中,NF-κB被激活后EGFP-p65转移到细胞核内。本产品转染HEK293T细胞的效果如图1所示。

图1.碧云天pCMV-EGFP-p65质粒转染HEK293T细胞效果图。pCMV-EGFP-p65质粒转染HEK293T细胞48小时后,经荧光显微镜观察,静息状态(Inactive state)下,EGFP-p65均匀分布在细胞质中。加入TNF-α (P6231)刺激HEK293T细胞后,激活状态(Active state)下,EGFP-p65进入细胞核内。实际荧光强度会因实验仪器、检测条件的不同而存在差异,本图仅供参考。

pCMV-EGFP-p65质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 61-568
EGFP 613-1329
human p65 1396-3045
SV40 poly(A) signal 3166-3287
f1 ori 3294-3749
Ampicillin resistance promoter 3776-3880
SV40 promoter 3882-4239
SV40 ori 4090-4225
Neomycin/Kanamycin resistance gene 4274-5068

pCMV-EGFP-p65质粒(6378bp)的图谱如下:

pCMV-EGFP-p65质粒的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2820 pCMV-EGFP-p65.pdf

pCMV-EGFP-p65中没有的酶切位点包括:

AbsI Acc113I AclI AcvI AhdI AhlI AjiI
AjuI AscI AsiSI Asp700I AspEI BaeI BarI
BbrPI BbvCI BcuI BmcAI BmeRI BmgBI BsePI
BsiWI BsmBI Bsp68I BssHII BssNAI Bst1107I BstZ17I
BtrI BtuMI CciNI DriI Eam1105I Eco32I Eco72I
EcoRV Esp3I FseI I-CeuI I-PpoI I-SceI MauBI
MluI MreI MroXI MssI Nb.BbvCI NotI NruI
Nt.BbvCI PacI PalAI PauI PdmI Pfl23II PI-PspI
PI-SceI PmaCI PmeI PmlI Psp1406I PspCI PspLI
PspXI PsrI PteI RgaI RigI RruI ScaI
SfaAI SgfI SgrAI SgrDI SgsI SmiI SpeI
SrfI SwaI TstI XmnI ZrmI

pCMV-EGFP-p65中的单酶切位点包括:

AseI AT`TA,AT 7 XcmI CCANNNN,N`NNNNTGG 3006
SnaBI TAC|GTA 340 XbaI T`CTAG,A 3049
NheI G`CTAG,C 591 BclI T`GATC,A 3059
BmtI G,CTAG`C 595 MfeI C`AATT,G 3152
AfeI AGC|GCT 596 HpaI GTT|AAC 3165
AgeI A`CCGG,T 600 AflII A`CRYG,T 3284
BsrGI T`GTAC,A 1322 DraIII CAC,NNN`GTG 3518
PaeR7I C`TCGA,G 1343 SexAI A`CCWGG,T 3991
XhoI C`TCGA,G 1343 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 4177
HindIII A`AGCT,T 1352 BspDI AT`CG,AT 4242
Acc65I G`GTAC,C 1375 ClaI AT`CG,AT 4242
KpnI G,GTAC`C 1379 EagI C`GGCC,G 4308
BamHI G`GATC,C 1390 KasI G`GCGC,C 4401
FspAI RTGC|GCAY 1609 NarI GG`CG,CC 4402
BstEII G`GTNAC,C 1620 SfoI GGC|GCC 4403
PflMI CCAN,NNN`NTGG 1737 PluTI G,GCGC`C 4405
KflI GG`GWC,CC 1890 PflFI GACN`N,NGTC 4520
SbfI CC,TGCA`GG 2180 Tth111I GACN`N,NGTC 4520
PshAI GACNN|NNGTC 2273 AflIII A`CRYG,T 6320
PvuI CG,AT`CG 2274 PciI A`CATG,T 6320
AarI CACCTGC(N)4`(N)4, 2670

pCMV-EGFP-p65质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

CMV-F primer (519-539): 5' -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

EGFP-C-5 primer (1266-1287): 5' -CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3'

SV40pA-R primer (3222-3203): 5' -GAAATTTGTGATGCTATTGC-3'

pCMV-EGFP-p65的全序列信息:D2820 pCMV-EGFP-p65全序列信息.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2820-1μg pCMV-EGFP-p65 1μg
D2820-100μg pCMV-EGFP-p65 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1μg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为100ng/µl,共1ml。可以直接用于转染细胞。
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GS056A EMSA探针-NF-κB (10μM) 30μl
GS056B 生物素标记EMSA探针-NF-κB (0.2μM) 200μl
GS056M EMSA突变探针-NF-κB (1.75μM) 60μl
GS056T EMSA突变探针-NF-κB (10μM) 30μl
S1523-10mg BAY 11-7082 (NF-κB抑制剂) 10mg
S1523-2mg BAY 11-7082 (NF-κB抑制剂) 20mg/ml×0.1ml
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S1809 PDTC (NF-κB抑制剂/抗氧化剂) 5g
SF0002-25mg WS3 (IκB/IKK抑制剂) 25mg
SF0002-5mg WS3 (IκB/IKK抑制剂) 5mg
SF0006-10mM WS6 (IκB/IKK抑制剂) 10mM×0.2ml
SF0006-25mg WS6 (IκB/IKK抑制剂) 25mg
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