pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur
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产品编号 D2799-1μg
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1μg 100μg
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pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有Flag标签(Flag Tag, DYKDDDDK)的目的蛋白、红色荧光蛋白mCherry和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达;可以方便地使用抗Flag标签的抗体(AF0036/AF5051/AF519)来检测目的蛋白;同时可以通过P2A共表达红色荧光蛋白mCherry,便于通过mCherry的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和mCherry的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和嘌呤霉素(Puromycin)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用Puromycin (ST551)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
FLAG 1713-1736
P2A 1806-1871
mCherry 1872-2582
T7 promoter 2634-2652
SV40 poly(A) signal 2926-3047
f1 ori 3054-3509
AmpR promoter 3536-3640
SV40 promoter 3642-3999
SV40 ori 3850-3985
PuroR 4034-4633
HSV TK poly(A) signal 4865-4912
ori 5241-5829

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒(5937bp)的图谱如下::

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2799 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur.pdf

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AcvI AfeI AflII AgeI Aor51HI
AscI AsiGI AsiSI BaeI BbrPI BfrI BlpI
BoxI Bpu1102I BshTI Bsp68I Bsp1720I BspQI BspTI
BssNAI Bst98I Bst1107I BstAFI BstENI BstPAI BstZ17I
BtuMI CelII CspAI Eco47III Eco72I EcoNI FseI
FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI LguI MauBI MreI
MspCI MssI NruI PalAI PciSI PI-PspI PI-SceI
PinAI PmaCI PmeI PmlI PpuMI PshAI Psp5II
PspCI PspPPI PspXI PsrI RgaI RigI SanDI
SapI SfaAI SgfI SgrDI SgsI SmiI SwaI
Vha464I XagI

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 1777 MluI A`CGCG,T 3048
ApaI G,GGCC`C 2587 NdeI CA`TA,TG 1274
BamHI G`GATC,C 1746 NheI G`CTAG,C 1631
BbsI GAAGACNN`NNNN, 2307 NotI GC`GGCC,GC 1702
BbvCI CC`TCA,GC 2410 PaeR7I C`TCGA,G 1788
BclI T`GATC,A 2819 PciI A`CATG,T 5885
BfuAI ACCTGCNNNN`NNNN, 4685 PflFI GACN`N,NGTC 4076
BglII A`GATC,T 1782 PflMI CCAN,NNN`NTGG 2311
BmgBI CAC|GTC 1850 PspOMI G`GGCC,C 2583
BmtI G,CTAG`C 1635 RsrII CG`GWC,CG 4150
BsgI GTGCAGNNNNNNNNNNNNNN,NN` 2466 SacI G,AGCT`C 1689
BsiWI C`GTAC,G 4090 SalI G`TCGA,C 1776
BspDI AT`CG,AT 4002 SbfI CC,TGCA`GG 2227
BspEI T`CCGG,A 4147 ScaI AGT|ACT 616
BspMI ACCTGCNNNN`NNNN, 4685 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3937
BsrGI T`GTAC,A 2572 SgrAI CR`CCGG,YG 2553
BssHII G`CGCG,C 4489 SmaI CCC|GGG 1741
BstBI TT`CG,AA 4649 SnaBI TAC|GTA 1380
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 1697 SpeI A`CTAG,T 1800
ClaI AT`CG,AT 4002 SrfI GCCC|GGGC 1741
CspCI ,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN` 1416 TspMI C`CCGG,G 1739
Eco53kI GAG|CTC 1687 Tth111I GACN`N,NGTC 4076
EcoRI G`AATT,C 1764 XbaI T`CTAG,A 1794
EcoRV GAT|ATC 1772 XcmI CCANNNN,N`NNNNTGG 2558
HindIII A`AGCT,T 1752 XhoI C`TCGA,G 1788
HpaI GTT|AAC 2925 XmaI C`CCGG,G 1739
MfeI C`AATT,G 2912 XmnI GAANN|NNTTC 735

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

mCherry primer (1874-1890): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur的的全序列信息:D2799 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2799-1µg pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg
D2799-100µg pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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C0533-0.5ml Lipo8000™转染试剂 0.5ml
C0533-1.5ml Lipo8000™转染试剂 1.5ml
C0533-7.5ml Lipo8000™转染试剂 7.5ml
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D2640 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo 1µg/100µg
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D2723 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2734 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2738 pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2757 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2796 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2797 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2798 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg 1µg/100µg
D2801 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2803 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2807 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2808 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2812 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2813 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Zeo 1µg/100µg
D2814 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla 1µg/100µg
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