pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur
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产品编号 D2824-1μg
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¥ 888.00
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1μg 100μg
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pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达目的蛋白、红色荧光蛋白mCherry和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达,同时可以通过P2A共表达红色荧光蛋白mCherry,便于通过mCherry的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和mCherry的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和嘌呤霉素(Puromycin)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用Puromycin (ST551)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
P2A 1769-1834
mCherry 1835-2542
HA 2549-2575
T7 promoter 2630-2648
SV40 poly(A) signal 2922-3043
f1 ori 3050-3505
AmpR promoter 3532-3636
SV40 promoter 3638-3995
SV40 ori 3846-3981
PuroR 4030-4629
HSV TK poly(A) signal 4861-4908
ori 5237-5825

pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur质粒(5933bp)的图谱如下:

pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur的多克隆位点的详细图谱如下: https://www.beyotime.com/Manual/D2824 pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur.pdf

pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AcvI AfeI AgeI AhlI Aor51HI
AscI AsiGI AsiSI BaeI BbrPI BcuI BlpI
BoxI Bpu1102I BshTI Bsp68I Bsp1720I BspQI BssNAI
Bst1107I BstENI BstPAI BstZ17I BtuMI CelII CspAI
Eco47III Eco72I EcoNI FseI FspAI I-CeuI I-PpoI
I-SceI LguI MauBI MreI MssI NruI PalAI
PciSI PI-PspI PI-SceI PinAI PmaCI PmeI PmlI
PpuMI PshAI Psp5II PspCI PspPPI PspXI PsrI
RgaI RigI SanDI SapI SfaAI SgfI SgrDI
SgsI SmiI SpeI SwaI XagI

pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 1752 MfeI C`AATT,G 2908
AflII C`TTAA,G 2574 MluI A`CGCG,T 3044
ApaI G,GGCC`C 2583 NdeI CA`TA,TG 1274
BamHI G`GATC,C 1721 NheI G`CTAG,C 1631
BbsI GAAGACNN`NNNN, 2270 NotI GC`GGCC,GC 1702
BbvCI CC`TCA,GC 2373 PaeR7I C`TCGA,G 1763
BclI T`GATC,A 2815 PciI A`CATG,T 5881
BfuAI ACCTGCNNNN`NNNN, 4681 PflFI GACN`N,NGTC 4072
BglII A`GATC,T 1757 PflMI CCAN,NNN`NTGG 2274
BmgBI CAC|GTC 1813 PspOMI G`GGCC,C 2579
BmtI G,CTAG`C 1635 RsrII CG`GWC,CG 4146
BsgI GTGCAGNNNNNNNNNNNNNN,NN` 2429 SacI G,AGCT`C 1689
BsiWI C`GTAC,G 4086 SalI G`TCGA,C 1751
BspDI AT`CG,AT 3998 SbfI CC,TGCA`GG 2190
BspEI T`CCGG,A 4143 ScaI AGT|ACT 616
BspMI ACCTGCNNNN`NNNN, 4681 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3933
BsrGI T`GTAC,A 2535 SgrAI CR`CCGG,YG 2516
BssHII G`CGCG,C 4485 SmaI CCC|GGG 1716
BstBI TT`CG,AA 4645 SnaBI TAC|GTA 1380
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 1697 SrfI GCCC|GGGC 1716
ClaI AT`CG,AT 3998 TspMI C`CCGG,G 1714
CspCI ,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN` 1416 Tth111I GACN`N,NGTC 4072
Eco53kI GAG|CTC 1687 XbaI T`CTAG,A 2543
EcoRI G`AATT,C 1739 XcmI CCANNNN,N`NNNNTGG 2521
EcoRV GAT|ATC 1747 XhoI C`TCGA,G 1763
HindIII A`AGCT,T 1727 XmaI C`CCGG,G 1714
HpaI GTT|AAC 2921 XmnI GAANN|NNTTC 735

pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

mCherry primer (1837-1853): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur的全序列信息:D2824 pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur 全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2824-1µg pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur 1µg
D2824-100µg pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-MCS-P2A-mCherry-HA-Pur质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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C0533-1.5ml Lipo8000™转染试剂 1.5ml
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