pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和新霉素(Neomycin)抗性基因的表达质粒。
本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达，同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP，便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。
图1. 碧云天pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。
本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。
本质粒为卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)抗性。可利用其卡那霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后，可使用G-418 (ST081/ST082)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV enhancer | 67-370 |
| CMV promoter | 371–574 |
| T3 promoter | 620–638 |
| P2A | 744-800 |
| EGFP | 801-1517 |
| Flag | 1524-1547 |
| T7 promoter | 1602–1620 |
| SV40 poly(A) signal | 1894–2015 |
| f1 ori | 2022–2475 |
| AmpR promoter | 2502–2606 |
| SV40 promoter | 2608–2965 |
| SV40 ori | 2816-2951 |
| NeoR/KanR | 3000–3794 |
| HSV-thymidine kinase (TK) poly(A )signal | 4026–4073 |
| Ori | 4402–4990 |
pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo质粒(5098bp)的图谱如下：
pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo的多克隆位点的详细图谱如下：https://www.beyotime.com/Manual/D2633 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo.pdf。
pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo中没有的酶切位点包括：
| AclI | AfeI | AflII | AhdI | AscI | AsiSI | BaeI |
| BbsI | BbvCI | BlpI | BsiWI | BspEI | BspQI | BssHII |
| BstEII | BstZ17I | EarI | EcoNI | FseI | NruI | PaqCI |
| PflMI | PmeI | PmlI | PpuMI | PshAI | PspXI | SapI |
| SbfI | ScaI | SgrAI | SpeI | SwaI | XcmI | XmnI |
pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo中的单酶切位点包括：
| AccI | GT`MK,AC | 718 | MluI | A`CGCG,T | 2016 |
| ApaI | G,GGCC`C | 1555 | MscI | TGG|CCA | 3210 |
| ApaLI | G`TGCA,C | 4732 | NarI | GG`CG,CC | 3128 |
| BamHI | G`GATC,C | 687 | NdeI | CA`TA,TG | 240 |
| BcgI | ,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` | 891 | NheI | G`CTAG,C | 597 |
| BclI | T`GATC,A | 1787 | NotI | GC`GGCC,GC | 668 |
| BglII | A`GATC,T | 723 | PaeR7I | `GCGC,C | 729 |
| BmgBI | CAC|GTC | 779 | PciI | A`CATG,T | 5046 |
| BmtI | G,CTAG`C | 601 | PflFI | GACN`N,NGTC | 3246 |
| BsaI | GGTCTCN`NNNN | 4117 | PluTI | G,GCGC`C | 3131 |
| BsaXI | ,NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` | 2180 | PspOMI | G`GGCC,C | 1551 |
| BsmBI | CGTCTCN`NNNN, | 769 | PstI | C,TGCA`G | 703 |
| BspDI | AT`CG,AT | 2968 | PvuI | CG,AT`CG | 1633 |
| BsrDI | GCAATG,NN` | 3361 | RsrII | CG`GWC,CG | 3644 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 1510 | SacI | G,AGCT`C | 655 |
| BstBI | TT`CG,AA | 3810 | SacII | CC,GC`GG | 662 |
| BstXI | CCAN,NNNN`NTGG | 663 | SalI | G`TCGA,C | 717 |
| ClaI | AT`CG,AT | 2968 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 2903 |
| CspCI | NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 382 | SfoI | GGC|GCC | 3129 |
| DraIII | CAC,NNN`GTG | 2246 | SmaI | CCC|GGG | 682 |
| Eco53KI | GAG|CTC | 653 | SnaBI | TAC|GTA | 346 |
| EcoRI | G`AATT,C | 705 | SrfI | GCCC|GGGC | 682 |
| EcoRV | GAT|ATC | 713 | StuI | AGG|CCT | 2949 |
| Esp3I | CGTCTCN`NNNN, | 769 | TspMI | C`CCGG,G | 680 |
| HindIII | A`AGCT,T | 693 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 3246 |
| HpaI | GTT|AAC | 1893 | XbaI | T`CTAG,A | 1518 |
| KasI | G`GCGC,C | 3127 | XhoI | C`TCGA,G | 729 |
| MfeI | C`AATT,G | 1880 | XmaI | C`CCGG,G | 680 |
pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo质粒中对于插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物EGFP primer的序列如下：
T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'
EGFP primer (803-819): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'
pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo的全序列信息：D2633 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo 全序列.txt
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D2633-1µg | pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo | 1µg |
| D2633-100µg | pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Neo | 100µg |
| — | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
