pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur
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产品编号 D2801-100μg
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1μg 100μg
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pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中 同 时 表 达N端带有HA标 签(HA Tag, YPYDVPDYA)的目的蛋白、红色荧光蛋白mCherry和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有CMV启动子可以高效启动目的基因的表达;可以方便地使用抗HA标签的抗体(AF5057/AF2305/AF0039/AH158) 来检测目的蛋白;同时可以通过P2A共表达红色荧光蛋白mCherry,便于通过mCherry的荧光特性监测目的蛋白的表达情 况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和mCherry的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和嘌呤霉素(Puromycin)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用 Puromycin (ST551)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
HA 1712-1738
P2A 1808-1873
mCherry 1874-2584
T7 promoter 2636-2654
SV40 poly(A) signal 2928-3049
f1 ori 3056-3511
AmpR promoter 3538-3642
SV40 promoter 3644-4001
SV40 ori 3852-3987
PuroR 4036-4635
HSV TK poly(A) signal 4867-4914
ori 5243-5831

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒(5939bp)的图谱如下::

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2801 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur.pdf

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AcvI AfeI AflII AgeI Aor51HI
AscI AsiGI AsiSI BaeI BbrPI BfrI BlpI
BoxI Bpu1102I BshTI Bsp68I Bsp1720I BspQI BspTI
BssNAI Bst98I Bst1107I BstAFI BstENI BstPAI BstXI
BstZ17I BtuMI CelII CspAI Eco47III Eco72I EcoNI
FseI FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI LguI MauBI
MreI MspCI MssI NruI PalAI PciSI PI-PspI
PI-SceI PinAI PmaCI PmeI PmlI PpuMI PshAI
Psp5II PspCI PspPPI PspXI PsrI RgaI RigI
SanDI SapI SfaAI SgfI SgrDI SgsI SmiI
SwaI Vha464I XagI

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 1779 MluI A`CGCG,T 3050
AleI CACNN|NNGTG 2516 NdeI CA`TA,TG 1274
ApaI G,GGCC`C 2589 NotI GC`GGCC,GC 1701
BamHI G`GATC,C 1748 PaeR7I C`TCGA,G 1790
BbsI GAAGACNN`NNNN, 2309 PciI A`CATG,T 5887
BbvCI CC`TCA,GC 2412 PflFI GACN`N,NGTC 4078
BclI T`GATC,A 2821 PspOMI G`GGCC,C 2585
BfuAI ACCTGCNNNN`NNNN, 4687 RsrII CG`GWC,CG 4152
BglII A`GATC,T 1784 SacI G,AGCT`C 1689
BmgBI CAC|GTC 1852 SacII CC,GC`GG 4250
BsgI GTGCAGNNNNNNNNNNNNNN,NN` 2468 SalI G`TCGA,C 1778
BsiWI C`GTAC,G 4092 SbfI CC,TGCA`GG 2229
BspDI AT`CG,AT 4004 ScaI AGT|ACT 616
BspEI T`CCGG,A 4149 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3939
BspMI ACCTGCNNNN`NNNN, 4687 SgrAI CR`CCGG,YG 2555
BsrGI T`GTAC,A 2574 SmaI CCC|GGG 1743
BssHII G`CGCG,C 4491 SnaBI TAC|GTA 1380
BstBI TT`CG,AA 4651 SpeI A`CTAG,T 1802
ClaI AT`CG,AT 4004 SrfI GCCC|GGGC 1743
CspCI ,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN` 1416 TspMI C`CCGG,G 1741
Eco53kI GAG|CTC 1687 Tth111I GACN`N,NGTC 4078
EcoRI G`AATT,C 1766 XbaI T`CTAG,A 1796
EcoRV GAT|ATC 1774 XcmI CCANNNN,N`NNNNTGG 2560
HindIII A`AGCT,T 1754 XhoI C`TCGA,G 1790
HpaI GTT|AAC 2927 XmaI C`CCGG,G 1741
MfeI C`AATT,G 2914 XmnI GAANN|NNTTC 735

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

mCherry primer (1876-1892): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur的的全序列信息:D2801 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2801-1µg pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg
D2801-100µg pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur 100µg
说明书 1份
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Pur质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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C0533-0.5ml Lipo8000™转染试剂 0.5ml
C0533-1.5ml Lipo8000™转染试剂 1.5ml
C0533-7.5ml Lipo8000™转染试剂 7.5ml
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D2640 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo 1µg/100µg
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D2723 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2734 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2738 pCMV-N-His-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2757 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Neo 1µg/100µg
D2795 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2796 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2797 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Hyg 1µg/100µg
D2798 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg 1µg/100µg
D2799 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2803 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-mCherry-Pur 1µg/100µg
D2807 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2808 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Bla 1µg/100µg
D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
D2810 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2811 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2812 pCMV-N-Myc-MCS-P2A-EGFP-Zeo 1µg/100µg
D2813 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Zeo 1µg/100µg
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