pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有Flag标签(Flag Tag, DYKDDDDK)的目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和新霉素(Neomycin)抗性基因的表达表达质粒。
本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达；可以方便地使用抗Flag标签的抗体(AF0036/AF5051/AF519)来检测目的蛋白；同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP，便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。
图1. 碧云天pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。
本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。
本质粒为卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)抗性。可利用其卡那霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后，可使用G-418 (ST081/ST082)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV enhancer | 67-370 |
| CMV promoter | 371-574 |
| T3 promoter | 620-638 |
| FLAG | 679-702 |
| P2A | 781-837 |
| EGFP | 838-1557 |
| T7 promoter | 1609-1627 |
| SV40 poly(A) signal | 1901-2022 |
| f1 ori | 2029-2484 |
| AmpR promoter | 2511-2615 |
| SV40 promoter | 2617-2974 |
| SV40 ori | 2825-2960 |
| NeoR/KanR | 3009-3803 |
| HSV TK poly(A) signal | 4035-4082 |
| Ori | 4411-4999 |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒(5107bp)的图谱如下：
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo的多克隆位点的详细图谱如下：https://www.beyotime.com/Manual/D2723 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo.pdf。
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AccIII | Acc113I | AccB7I | AclI | AcvI |
| AfeI | AflII | AgeI | AhdI | Aor13HI | Aor51HI | AscI |
| AsiGI | AsiSI | Asp700I | AspEI | BaeI | BbrPI | BbsI |
| BbvCI | BfrI | BlpI | BmcAI | BmeRI | BoxI | BpiI |
| Bpu1102I | BpuAI | BseAI | BsePI | BshTI | BsiWI | Bsp13I |
| Bsp68I | Bsp1720I | BspEI | BspQI | BspTI | BssHII | BssNAI |
| Bst6I | Bst98I | Bst1107I | BstAFI | BstEII | BstENI | BstPI |
| BstPAI | BstV2I | BstZ17I | BtuMI | CelII | CspAI | DriI |
| Eam1104I | Eam1105I | EarI | Eco47III | Eco72I | Eco91I | EcoNI |
| EcoO65I | FseI | FspAI | I-CeuI | I-PpoI | I-SceI | KflI |
| Kpn2I | Ksp632I | LguI | MauBI | MreI | MroI | MroXI |
| MspCI | MssI | Nb.BbvCI | NruI | Nt.BbvCI | Nt.BspQI | PalAI |
| PaqCI | PauI | PciSI | PdmI | Pfl23II | PflMI | PI-PspI |
| PI-SceI | PinAI | PmaCI | PmeI | PmlI | PpuMI | PshAI |
| Psp5II | Psp1406I | PspCI | PspEI | PspLI | PspPPI | PspXI |
| PsrI | PteI | RgaI | RigI | RruI | SanDI | SapI |
| SbfI | ScaI | SdaI | SfaAI | SgfI | SgrAI | SgrDI |
| SgsI | SmiI | Sse8387I | SwaI | Van91I | Vha464I | XagI |
| XcmI | XmnI | ZrmI |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo中的单酶切位点包括：
| AccI | GT`MK,AC | 743 | MscI | TGG|CCA | 3219 |
| ApaI | G,GGCC`C | 1562 | NarI | GG`CG,CC | 3137 |
| ApaLI | G`TGCA,C | 4741 | NdeI | CA`TA,TG | 240 |
| BamHI | G`GATC,C | 712 | NheI | G`CTAG,C | 597 |
| BcgI | ,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` | 928 | NotI | GC`GGCC,GC | 668 |
| BclI | T`GATC,A | 1794 | PaeR7I | C`TCGA,G | 754 |
| BglII | A`GATC,T | 748 | PciI | A`CATG,T | 5055 |
| BmgBI | CAC|GTC | 816 | PflFI | GACN`N,NGTC | 3255 |
| BmtI | G,CTAG`C | 601 | PluTI | G,GCGC`C | 3140 |
| BsaI | GGTCTCN`NNNN, | 4126 | PspOMI | G`GGCC,C | 1558 |
| BsaXI | ,NNN`(N)9ACNNNNNCTCC(N)7,NNN` | 2187 | PstI | C,TGCA`G | 728 |
| BsmBI | CGTCTCN`NNNN, | 806 | PvuI | CG,AT`CG | 1640 |
| BspDI | AT`CG,AT | 2977 | RsrII | CG`GWC,CG | 3653 |
| BsrDI | GCAATG,NN` | 3370 | SacI | G,AGCT`C | 655 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 1547 | SacII | CC,GC`GG | 662 |
| BstBI | TT`CG,AA | 3819 | SalI | G`TCGA,C | 742 |
| BstXI | CCAN,NNNN`NTGG | 663 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 2912 |
| ClaI | AT`CG,AT | 2977 | SfoI | GGC|GCC | 3138 |
| CspCI | ,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN` | 382 | SmaI | CCC|GGG | 707 |
| DraIII | CAC,NNN`GTG | 2253 | SnaBI | TAC|GTA | 346 |
| Eco53kI | GAG|CTC | 653 | SpeI | A`CTAG,T | 766 |
| EcoRI | G`AATT,C | 730 | SrfI | GCCC|GGGC | 707 |
| EcoRV | GAT|ATC | 738 | StuI | AGG|CCT | 2958 |
| Esp3I | CGTCTCN`NNNN, | 806 | TspMI | C`CCGG,G | 705 |
| HindIII | A`AGCT,T | 718 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 3255 |
| HpaI | GTT|AAC | 1900 | XbaI | T`CTAG,A | 760 |
| KasI | G`GCGC,C | 3136 | XhoI | C`TCGA,G | 754 |
| MfeI | C`AATT,G | 1887 | XmaI | C`CCGG,G | 705 |
| MluI | A`CGCG,T | 2023 |
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒中对于插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物EGFP primer的序列如下：
T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'
EGFP primer (840-856): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'
pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo的全序列信息：D2723 pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo 全序列.txt
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D2723-1µg | pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo | 1µg |
| D2723-100µg | pCMV-N-Flag-MCS-P2A-EGFP-Neo | 100µg |
| — | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
