pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla
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产品编号 D2814-100μg
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¥ 1169.00
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1μg 100μg
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pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和灭瘟素S (Blasticidin S)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达,同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP,便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。本图仅供参考,实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和灭瘟素S (Blasticidin S)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后,可使用Blasticidin S (ST018)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
AmpR 63-923
AmpR promoter 924-1016
CMV enhancer 1101-1404
CMV promoter 1405-1608
T3 promoter 1654-1672
P2A 1769-1834
EGFP 1835-2551
HA 2558-2584
T7 promoter 2639-2657
SV40 poly(A) signal 2931-3052
f1 ori 3059-3514
AmpR promoter 3541-3645
SV40 promoter 3647-4004
SV40 ori 3855-3990
BSD 4039-4437
HSV TK poly(A) signal 4669-4716
ori 5045-5633

pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla质粒(5741bp)的图谱如下:

pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2814 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla.pdf

pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII AccB7I AcvI AfeI AgeI
AhlI Aor13HI Aor51HI AscI AsiGI AsiSI AspI
BaeI BbeI BbrPI BbvCI BcuI BoxI BseAI
BsePI BshTI BsiWI Bsp13I BspEI BspQI BssHII
BssNAI Bst1107I BstEII BstENI BstPI BstPAI BstZ17I
CpoI CspI CspAI DinI Eco47III Eco72I Eco91I
EcoNI EcoO65I EgeI EheI FseI FspAI I-CeuI
I-PpoI I-SceI KasI Kpn2I LguI MauBI Mly113I
MreI MroI MssI NarI PalAI PauI PciSI
Pfl23II PflFI PflMI PI-PspI PI-SceI PinAI PluTI
PmaCI PmeI PmlI PshAI PspCI PspEI PspLI
PspXI PsrI PsyI RgaI RigI RsrII Rsr2I
SanDI SapI SbfI SdaI SfaAI SfoI SgfI
SgrAI SgrDI SgsI SmiI SpeI Sse8387I SspDI
SwaI Tth111I Van91I XagI XcmI

pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla中的单酶切位点包括:

AccI GT`MK,AC 1752 HpaI GTT|AAC 2930
AhdI GACNN,N`NNGTC 2583 MfeI C`AATT,G 2917
AflII C`TTAA,G 136 MluI A`CGCG,T 3053
ApaI G,GGCC`C 2592 MscI TGG|CCA 4042
BamHI G`GATC,C 1721 NdeI CA`TA,TG 1274
BbsI GAAGACNN`NNNN, 4124 NheI G`CTAG,C 1631
BclI T`GATC,A 2824 NotI GC`GGCC,GC 1702
BfuAI ACCTGCNNNN`NNNN, 4489 NruI TCG|CGA 4270
BglII A`GATC,T 1757 PaeR7I C`TCGA,G 1763
BlpI GC`TNA,GC 4434 PciI A`CATG,T 5689
BmgBI CAC|GTC 1813 PpuMI RG`GWC,CY 4198
BmtI G,CTAG`C 1635 PspOMI G`GGCC,C 2588
BsaXI ,NNN`(N)9ACNNNNNCTCCNNNNNNN,NNN` 3217 PstI C,TGCA`G 1737
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 1803 SacI G,AGCT`C 1689
BspDI AT`CG,AT 4007 SacII CC,GC`GG 1696
BspMI ACCTGCNNNN`NNNN, 4489 SalI G`TCGA,C 1751
BsrGI T`GTAC,A 2544 ScaI AGT|ACT 616
BstBI TT`CG,AA 4453 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3942
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 1697 SmaI CCC|GGG 1716
ClaI AT`CG,AT 4007 SnaBI TAC|GTA 1380
DraIII CAC,NNN`GTG 3283 SrfI GCCC|GGGC 1716
EarI CTCTTCN`NNN, 931 StuI AGG|CCT 3985
Eco53kI GAG|CTC 1687 TspMI C`CCGG,G 1714
EcoRI G`AATT,C 1739 XbaI T`CTAG,A 2552
EcoRV GAT|ATC 1747 XhoI C`TCGA,G 1763
Esp3I CGTCTCN`NNNN, 1803 XmaI C`CCGG,G 1714
HindIII A`AGCT,T 1727 XmnI GAANN|NNTTC 735

pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla质粒中对插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物EGFP primer的序列如下:

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

EGFP primer (1837-1853): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla的全序列信息:D2814 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2814-1µg pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla 1µg
D2814-100µg pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Bla质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。构建的质粒可以用常规方法转染细胞。
参考文献:
1.Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18556.
2.Ryan MD, King AM, Thomas GP. J Gen Virol. 1991. 72(11):2727-32.
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C0533-0.5ml Lipo8000™转染试剂 0.5ml
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D2809 pCMV-MCS-P2A-EGFP-Flag-Bla 1µg/100µg
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