pCMV-EGFP-p65是碧云天自行研发生产的在哺乳动物细胞中表达EGFP标签的p65融合蛋白的质粒。该质粒含有CMV启动子，带有卡那霉素(Kanamycin)抗性，可以使用G418 (ST081)筛选稳定表达融合蛋白的细胞株，是研究NF-κB信号通路的激活和抑制的有效工具。本产品主要适合用于通过荧光显微镜等活细胞观察NF-κB的核转运激活。
NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)，中文名为激活的B细胞核因子kappa-轻链增强子，是细胞内重要的核转录因子，参与细胞对外界刺激的响应、炎症反应、免疫应答等过程，几乎存在于所有类型的动物细胞中。NF-κΒ作为转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (REL-associated protein, Rel-A)、Rel-B和c-Rel，它们的N端都具有高度保守的RHD (REL homology domain)；5个亚单位根据C端结构域的不同被分为两类，第一类为p50、p52，其C端具有ankyrin重复结构域具有转录抑制活性(Transrepression activity)和招募IKK (Inhibitory κB kinase)的致死结构域(Dead domain)；第二类为p65、Rel-B和c-Rel，其C端具有转录所必需的转录激活结构域(Transactivation domain, TAD)[1]。
NF-κB在静息状态或失活状态(Resting state or inactive state)下，其高度保守的RHD中的核定位信号(Nuclear localization sequence, NLS)与抑制因子IκB (Inhibitor of NF-κB)结合形成非活性复合物，NF-κB以失活状态存在于细胞质中。虽然IκB蛋白掩盖了p65的NLS信号，但没有掩盖p50的NLS信号，因此静息状态下NF-κB可以持续在细胞核和细胞质之间穿梭(Shuttle)维持很低水平的活性[2]。
NF-κB的激活存在两条途径，即经典途径和非经典途径。经典途径：在受到促炎信号(如炎症细胞因子TNF-α、IL-1、病原体和病毒双链RNA等)的刺激后，使细胞中的IKK复合物被招募并激活，IKK复合物由IKKα和/或IKKβ催化亚基以及NEMO (NF-κB Essential Modulator，亦称IKKγ)组成，IKK复合物使IκB被磷酸化，磷酸化的IκB随后发生泛素化被蛋白酶体降解，使得NF-κB的核定位信号暴露从而进入细胞核激活靶基因；非经典途径：该途径由NF-κB抑制激酶NIK (NF-κB inhibitory kinase)介导，NIK磷酸化并激活IKK的亚基IKKα，磷酸化的IKKα再使p100磷酸化，导致加工和释放有活性的p52和RelB异源二聚体转移至细胞核并激活靶标基因，这一过程发生在淋巴器官发育期间，淋巴器官负责产生B淋巴细胞和T淋巴细胞[2]。
pCMV-EGFP-p65转染细胞后通过荧光显微镜观察，静息状态下EGFP-p65均匀的分布在细胞质中，NF-κB被激活后EGFP-p65转移到细胞核内。本产品转染HEK293T细胞的效果如图1所示。
图1.碧云天pCMV-EGFP-p65质粒转染HEK293T细胞效果图。pCMV-EGFP-p65质粒转染HEK293T细胞48小时后，经荧光显微镜观察，静息状态(Inactive state)下，EGFP-p65均匀分布在细胞质中。加入TNF-α (P6231)刺激HEK293T细胞后，激活状态(Active state)下，EGFP-p65进入细胞核内。实际荧光强度会因实验仪器、检测条件的不同而存在差异，本图仅供参考。
pCMV-EGFP-p65质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 61-568 |
| EGFP | 613-1329 |
| human p65 | 1396-3045 |
| SV40 poly(A) signal | 3166-3287 |
| f1 ori | 3294-3749 |
| Ampicillin resistance promoter | 3776-3880 |
| SV40 promoter | 3882-4239 |
| SV40 ori | 4090-4225 |
| Neomycin/Kanamycin resistance gene | 4274-5068 |
pCMV-EGFP-p65质粒(6378bp)的图谱如下：
pCMV-EGFP-p65质粒的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D2820 pCMV-EGFP-p65.pdf
pCMV-EGFP-p65中没有的酶切位点包括：
| AbsI | Acc113I | AclI | AcvI | AhdI | AhlI | AjiI |
| AjuI | AscI | AsiSI | Asp700I | AspEI | BaeI | BarI |
| BbrPI | BbvCI | BcuI | BmcAI | BmeRI | BmgBI | BsePI |
| BsiWI | BsmBI | Bsp68I | BssHII | BssNAI | Bst1107I | BstZ17I |
| BtrI | BtuMI | CciNI | DriI | Eam1105I | Eco32I | Eco72I |
| EcoRV | Esp3I | FseI | I-CeuI | I-PpoI | I-SceI | MauBI |
| MluI | MreI | MroXI | MssI | Nb.BbvCI | NotI | NruI |
| Nt.BbvCI | PacI | PalAI | PauI | PdmI | Pfl23II | PI-PspI |
| PI-SceI | PmaCI | PmeI | PmlI | Psp1406I | PspCI | PspLI |
| PspXI | PsrI | PteI | RgaI | RigI | RruI | ScaI |
| SfaAI | SgfI | SgrAI | SgrDI | SgsI | SmiI | SpeI |
| SrfI | SwaI | TstI | XmnI | ZrmI |
pCMV-EGFP-p65中的单酶切位点包括：
| AseI | AT`TA,AT | 7 | XcmI | CCANNNN,N`NNNNTGG | 3006 |
| SnaBI | TAC|GTA | 340 | XbaI | T`CTAG,A | 3049 |
| NheI | G`CTAG,C | 591 | BclI | T`GATC,A | 3059 |
| BmtI | G,CTAG`C | 595 | MfeI | C`AATT,G | 3152 |
| AfeI | AGC|GCT | 596 | HpaI | GTT|AAC | 3165 |
| AgeI | A`CCGG,T | 600 | AflII | A`CRYG,T | 3284 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 1322 | DraIII | CAC,NNN`GTG | 3518 |
| PaeR7I | C`TCGA,G | 1343 | SexAI | A`CCWGG,T | 3991 |
| XhoI | C`TCGA,G | 1343 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 4177 |
| HindIII | A`AGCT,T | 1352 | BspDI | AT`CG,AT | 4242 |
| Acc65I | G`GTAC,C | 1375 | ClaI | AT`CG,AT | 4242 |
| KpnI | G,GTAC`C | 1379 | EagI | C`GGCC,G | 4308 |
| BamHI | G`GATC,C | 1390 | KasI | G`GCGC,C | 4401 |
| FspAI | RTGC|GCAY | 1609 | NarI | GG`CG,CC | 4402 |
| BstEII | G`GTNAC,C | 1620 | SfoI | GGC|GCC | 4403 |
| PflMI | CCAN,NNN`NTGG | 1737 | PluTI | G,GCGC`C | 4405 |
| KflI | GG`GWC,CC | 1890 | PflFI | GACN`N,NGTC | 4520 |
| SbfI | CC,TGCA`GG | 2180 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 4520 |
| PshAI | GACNN|NNGTC | 2273 | AflIII | A`CRYG,T | 6320 |
| PvuI | CG,AT`CG | 2274 | PciI | A`CATG,T | 6320 |
| AarI | CACCTGC(N)4`(N)4, | 2670 |
pCMV-EGFP-p65质粒中推荐使用的测序引物序列如下：
CMV-F primer (519-539): 5' -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
EGFP-C-5 primer (1266-1287): 5' -CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3'
SV40pA-R primer (3222-3203): 5' -GAAATTTGTGATGCTATTGC-3'
pCMV-EGFP-p65的全序列信息:D2820 pCMV-EGFP-p65全序列信息.txt
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D2820-1μg | pCMV-EGFP-p65 | 1μg |
| D2820-100μg | pCMV-EGFP-p65 | 100μg |
| － | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
