E. coli DNA Ligase
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产品编号 D7016S
数量
¥ 168.00
产品包装:
200U 1KU 5KU
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碧云天生产的E. coli DNA Ligase,即大肠杆菌DNA连接酶,由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的重组酶。E. coli DNA Ligase是一种以NAD+ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)为辅酶,Mg2+依赖的,催化双链DNA中5'磷酸和3'羟基之间形成磷酸二酯键,即催化双链DNA粘性末端连接或双链DNA中的缺刻修复的DNA连接酶[1]。

E. coli DNA Ligase可催化双链DNA相邻粘性末端5'磷酸和3'羟基磷酸二酯键的形成,但常规条件下不能进行平末端双链DNA的连接。在添加10-15% PEG和适当高浓度的单价阳离子时,也可以催化平末端双链DNA的连接反应。E. coli DNA Ligase在一定温度范围内(4-37℃)均具有活性,同时可以被热失活(65℃孵育20分钟)。

碧云天生产的E. coli DNA Ligase连接粘性末端双链线性DNA的效果请参考图1:

图1. 碧云天生产的E. coli DNA Ligase连接粘性末端双链线性DNA的效果图。利用碧云天生产的BeyoFusion™ DNA Polymerase (D7220),使用两端带有Hind III酶切位点的引物对靶基因进行PCR扩增,生成两种不同长度的两端带有HindⅢ酶切位点的平末端双链线性DNA分子(900bp和600bp),随后使用碧云天Hind III (D6389)对PCR产物进行酶切,获得两端带有互补粘性末端的双链线性DNA分子,分别作为Substrate 1 (900bp)和Substrate 2 (600bp);在20µl反应体系(30mM Tris-HCl, 4mM MgCl2, 1mM DTT, 26μM NAD, 50μg/ml BSA, PH8.0 @25℃)中,分别加入400ng经PCR扩增及Hind III酶切产生的两种双链DNA片段,以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的E. coli DNA Ligase,16℃孵育30分钟进行连接,然后65℃孵育20分钟以终止反应。取出10μl反应产物,加入2μl 6X DNA Loading Buffer (D0071),然后进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有相当的连接粘性末端双链线性DNA的效果。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异,图中所示结果仅供参考。

用途:粘性末端双链DNA分子的连接;双链DNA的缺刻修复;cDNA第二链合成后的克隆[2]。

来源:纯化自携带编码E. coli DNA ligase的E. coli重组菌株。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of λ DNA (5' DNA termini concentration of 0.12μM, 300μg/ml) in a total reaction volume of 20μl in 30 minutes at 16℃ in 1X E. coli DNA Ligase Reaction Buffer。

纯度:不含除E. coli DNA Ligase之外的其它种类的DNA连接酶,不含内切酶和外切酶,不含RNA酶,不含磷酸酯酶。

酶储存液:10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 200µg/ml BSA, 50% Glycerol (pH7.4 @25℃)。

10X Reaction Buffer: 300mM Tris-HCl, 40mM MgCl2, 260μM NAD, 10mM DTT, 500μg/ml BSA (pH8.0 @25℃)。

失活或抑制:65℃孵育20分钟可使E. coli DNA Ligase失活。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7016S-1 E. coli DNA Ligase (10U/μl) 20µl
D7016S-2 10X Reaction Buffer 100µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7016M-1 E. coli DNA Ligase (10U/μl) 100µl
D7016M-2 10X Reaction Buffer 500µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7016L-1 E. coli DNA Ligase (10U/μl) 500µl
D7016L-2 10X Reaction Buffer 2ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,两年有效。10X Reaction Buffer建议长期保存于-80℃,以延长NAD半衰期。

注意事项:

E. coli DNA Ligase需要以NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 作为辅酶,而不是像T4 DNA连接酶等以ATP为辅酶。

E. coli DNA Ligase对于平末端片段的连接效率是极低的,对于平末端的连接建议使用T4 DNA Ligase。

E. coli DNA Ligase的催化底物是双链DNA分子,不能用于单链DNA或RNA的连接反应。

E. coli DNA Ligase连接反应需要以NAD作为辅助因子,10X Reaction Buffer中含有辅助因子NAD,因此10X Reaction Buffer建议长期保存于-80℃,以延长NAD半衰期。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.参考下表在冰浴中配制反应体系(以20μl体系为例):
Reagent Volume Final Concentration
dsDNA xμl up to 0.25μg/μl
10X Reaction Buffer 2μl 1X
E. coli DNA Ligase (10U/μl) 1μl 0.5U/μl
Nuclease-free Water (17-x)μl -
Total Volume 20μl -
注1:如果同时进行多个反应,可把上表中除底物DNA之外的所有组分预先混合,然后再分装到各反应管。
注2:E. coli DNA Ligase使用时宜存放在冰盒内或冰浴上。
2.轻轻震荡混匀或移液器反复吹打混匀,随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
3.反应条件:16℃孵育30-60分钟。
4.终止反应:反应结束后立即将反应产物在65℃条件下孵育20分钟,以终止反应。
5.将反应后的产物进行琼脂糖凝胶或聚丙烯凝胶电泳,拍照观察并分析连接效果。如果需要从琼脂糖凝胶中回收DNA样品,推荐使用D0056 DNA凝胶回收试剂盒;如果需要从酶切消化反应体系中纯化DNA样品,推荐使用D0033 PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒
6.其他用途请自行参考E. coli DNA Ligase的相关文献资料进行。
常见问题:
1.E. coli DNA Ligase和T4 DNA Ligase有什么区别?
在推荐的使用条件下,E. coli DNA Ligase不能连接平末端DNA或RNA分子[3]。
2.E. coli DNA Ligase能否被热失活?
可以。将E. coli DNA Ligase在65℃条件下孵育20分钟,即可使其完全失活。
3.应该选用哪种连接酶或连接试剂盒?
如果需要平末端或粘性末端的快速连接,建议使用快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase (D7006/D7008)是大多数DNA重组反应所选用的酶,可用于粘性末端(室温10分钟连接)或平末端(室温2小时或过夜)的连接。E. coli DNA Ligase对底物的选择比T4 DNA Ligase更具有特异性,如果只需要粘性末端的连接,抑制平末端或RNA分子的连接,建议使用E. coli DNA Ligase。如果实验目的是单链DNA或RNA分子的连接,建议使用T4 RNA Ligase (D7021)
参考文献:
1.Lehman IR. Science. 1974. 186(4166):790-7.
2.Okayama H and Berg P. Mol Cell Biol. 1982. 2(2):161-70.
3.Higgins NP and Cozzarelli NR. Methods Enzymol. 1979. 68:50-71.
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