碧云天的BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒(BeyoMag™ Animal mRNA Isolation Kit with Magnetic Beads)是一种使用Oligo (dT)₂₅包被的磁珠，配合优化的缓冲体系，用于稳定、高效、便捷地从新鲜、冻存、经EDTA、肝素等抗凝处理或经过RNALater™血液RNA稳定保存液(R0116)保存的血液中快速分离纯化出高纯度完整mRNA的试剂盒。

本试剂盒抽提的mRNA可直接应用于RT-PCR、qPCR、高通量测序、mRNA文库的构建、固相cDNA文库构建、Northern blot分析、RACE等分子生物学实验，还可用于mRNA疫苗的研发等[1-2]。

一个典型的哺乳血液细胞中，四种主要的大分子的质量和占比为：RNA, ∼20pg (1%); DNA, ~7pg (0.3%); protein, ∼500pg (20%); polysaccharide (多糖), ∼2μg (78.7%)。信使RNA (messenger RNA, 简称mRNA)约占总RNA质量的4%，核糖体RNA (ribosomal RNA, 简称rRNA)约占80% [3]。

本试剂盒的原理和主要操作流程如图1所示。BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠表面共价修饰了25聚dT序列即Oligo (dT)₂₅，当血液的裂解液与BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠混合后，磁珠表面的寡聚dT序列与mRNA 3'端的poly(A)进行碱基配对而特异性结合，然后在外界磁场的作用下，磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离，经洗涤充分去除杂质，最后用洗脱液将mRNA从磁珠上洗脱下来，即可获得高纯度完整mRNA [4-5]。

图1. BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒(R0095)的工作原理示意图。

本试剂盒具有提取效果稳定、纯度高、速度快、操作便捷等优点。本试剂盒的mRNA提取体系经过反复测试和优化，能从100µl新鲜小鼠血液抽提约0.1-1µg mRNA。仅需孵育、洗涤、洗脱等简单的操作，整个纯化过程不超过15分钟即可完成。所有操作都在同一个离心管中完成，操作便捷。本试剂盒及国内同类产品Competitor C抽提小鼠新鲜血液的mRNA的检测效果比较参见图2。

图2. BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒(R0095)用于从新鲜小鼠血液中抽提mRNA的效果图。使用本试剂盒及国内同类产品Competitor C抽提小鼠新鲜血液的mRNA，然后使用BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser) (D7185)进行cDNA合成，随后使用BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Low ROX)(D7262)和Actin、B2M和GAPDH三种内参引物进行qPCR检测，图中可见使用本试剂盒与同类产品抽提的mRNA，qPCR检测的Ct值基本一致。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒中的BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠粒径约为200nm，浓度约为5mg/ml。每毫克磁珠偶联的Oligo (dT)₂₅约为300-400pmol，每毫克磁珠可纯化约2-3µg mRNA。

对于常规的mRNA抽提，按照每个样品使用20μl磁珠悬浊液，本试剂盒小包装可用于50次mRNA抽提，中包装可用于200次mRNA抽提，大包装可用于800次mRNA抽提。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R0095S-1	BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠	1ml
R0095S-2	溶液I (结合液)	30ml
R0095S-3	溶液Ⅱ (裂解液)	30ml
R0095S-4	溶液Ⅲ(洗涤液I)	30ml
R0095S-5	溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ)	60ml
R0095S-6	溶液Ⅴ(洗脱液)	5ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
R0095M-1	BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠	4ml
R0095M-2	溶液I (结合液)	120ml
R0095M-3	溶液Ⅱ (裂解液)	120ml
R0095M-4	溶液Ⅲ(洗涤液I)	120ml
R0095M-5	溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ)	240ml
R0095M-6	溶液Ⅴ(洗脱液)	20ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
R0095L-1	BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠	16ml
R0095L-2	溶液I (结合液)	480ml
R0095L-3	溶液Ⅱ (裂解液)	480ml
R0095L-4	溶液Ⅲ(洗涤液I)	480ml
R0095L-5	溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ)	480ml×2
R0095L-6	溶液Ⅴ(洗脱液)	80ml
—	说明书	1份

保存条件：

4ºC保存，一年有效。其中BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠长期不使用时，可以-20ºC保存，-20ºC可以保存更长时间。

注意事项：

血液样品推荐使用碧云天生产的RNALater™血液RNA稳定保存液(R0116)进行保存以保持RNA的完整性。

操作过程要严格保证无RNA酶和DNA酶污染。对于操作环境中RNase的去除，推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。

本产品的所用试剂和耗材都要求是RNase-free和DNase-free的，操作时应小心，避免被污染。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。如果可能有DNase污染，通常高温高压灭菌可以使DNase灭活。

需自备磁分离装置，推荐使用碧云天的BeyoMag™磁分离架系列产品(FMS004、FMS008、FMS012、FMS016或FMS024)。

温度较低时，溶液II (裂解液)可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，可置于室温或者37ºC水浴溶解，混匀后使用。

分装或使用磁珠时，请适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。

磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。

请使用推荐的血液量，否则可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响抽提获得的mRNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善提取效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少总细胞量和总组织量。

由于mRNA容易降解，提取获得的mRNA推荐尽快用于RT-PCR等后续实验。如果不能尽快使用，需要-80ºC保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 准备工作。
a. 溶液I (结合液)、溶液II (裂解液)、溶液Ⅲ (洗涤液I)和溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ)使用前平衡至室温。溶液Ⅴ(洗脱液)在使用前置于冰上或者2-8ºC保存。如果溶液有沉淀，适当水浴或者振荡溶解。
b. 血液的准备。
(a) 收集50-100µl新鲜的红细胞无细胞核的血液样品，或5-10µl红细胞有细胞核的血液，加入含抗凝剂的抗凝管中，颠倒混匀。
注1：人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的红细胞无细胞核，鸟、鱼、蛙等的红细胞有细胞核。红细胞有细胞核会导致相同体积的血液内RNA的含量非常高。抗凝剂推荐使用EDTA钠盐或钾盐，肝素和柠檬酸盐也可以。
注2：白细胞的收集和保存在RNALater™血液RNA稳定保存液(R0116)中的血液样品，请参考RNALater™血液RNA稳定保存液的使用说明步骤1、2对血液样品进行处理。对于白细胞，由于不含红细胞，对于“红细胞有细胞核的血液”的血液体积可参考“红细胞无细胞核的血液样品”。
(b) 按照血液量加入下表中推荐的溶液II (裂解液/Lysis Buffer)。通过移液器吹打多次，裂解细胞至溶液变粘稠。
(c) 选做：加入溶液Ⅱ (裂解液)后样品可能会比较粘稠，可适当超声或使用1ml注射器反复抽吸打断基因组DNA从而使粘稠感消失。此操作会产生泡沫，但不影响mRNA的得率。
(d) 4ºC以14,000×g离心5分钟，并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化，或保存在-80ºC备用。
c. BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠的准备。
(a) 将磁珠溶液从4ºC冰箱取出，适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。参考下表，根据总细胞量或组织重量和样品数量，取适量的BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠悬液至一洁净离心管中。推荐使用BeyoGold™ 1.5毫升离心管(无色, Nuclease free) (FTUB306)。

Blood Volume	Lysis Buffer	Beads	Wash Solution I	Wash Solution Ⅱ
<50µl	100µl	20µl	500µl	500µl each time
50~100µl	300µl	40µl	500µl	500µl each time
100~300µl	600µl	100µl	500µl	500µl each time

(b) 无论磁珠用量多少，按照每个样品200µl溶液I (结合液)的量，加入适量溶液I (结合液)洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离30秒，去除上清。重复本步骤1次。说明：如果样品数量超过5个，可以考虑将适量磁珠悬液先直接置于磁 力架上分离30秒，去除上清，然后根据样品数量再加入适量溶液I (结合液)洗涤2次。
(c) 按照每个样品100µl溶液I (结合液)的量，加入适量溶液I (结合液)重悬磁珠。
2. 从血液中抽提mRNA。
a. 取上述制备好的血液样品与100µl洗涤后的磁珠在室温下旋转混合5分钟 。
b. 置于磁力架上分离1分钟，去除上清。
c. 室温下用500µl溶液Ⅲ(洗涤液I/Wash Solution I)洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。
注意：该步骤可能会出现絮凝物，增加洗涤次数，可使磁珠分散均匀，絮凝减少，絮凝不影响mRNA的抽提。
d. 室温下用500µl溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ/Wash Solution Ⅱ)洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。重复本步骤1次。
e. 根据后续实验需求，进行mRNA的洗脱：
(a) 从磁珠上洗脱mRNA：加入10-20µl溶液Ⅴ(洗脱液)或Nuclease-free的水，如DEPC水(R0021/R0022)或BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)，75-80ºC孵育2分钟，磁分离30秒，然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中，置于冰上待用。
注：建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解，建议尽快进行后续实验。短时间内不使用，请置于-80ºC保存。
(b) 如果mRNA不洗脱直接用于后续实验，如固相cDNA文库构建等，用500µl溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ)洗涤一次，再用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次，即可用于后续实验。
参考文献：
1. Wommer L, Soerjawinata W, Ulber R, Kampeis P. Eng Life Sci. 2021. 21(10): 558–572.
2. Chaudhary N, Weissman D & Whitehead K A. Nat Rev Drug Discov. 2021.20, 817–838.
3. Wu J, Xiao J, Zhang Z, Wang X, Hu S, Yu J. Genomics Proteom Bioinforma. 2014. 12(2):57-63.
4. Michael R Green, Joseph Sambrook. Cold Spring Harb Protoc. 2019.10:711-714.
5. Nicholas M. Adams, Hali Bordelon, et al. ACS Applied Materials & Interfaces. 2015. 7(11):6062-6069.
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产品编号	产品名称	包装
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