pET-N-His-SUMO3-Avi (Avi标签原核表达质粒)
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产品编号 D3009-1μg
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pET-N-His-SUMO3-Avi是碧云天自行研发的用于在大肠杆菌(E.coli)中表达可被生物素标记的目的蛋白的原核表达质粒。该质粒由T7启动子驱动N端带有His标签(His tag)、SUMO3标签(SUMO3 tag)以及Avi标签(Avi tag)的目的蛋白。在ATP、生物素(Biotin)以及生物素连接酶(Biotin ligase) BirA存在的体外条件下,BirA催化生物素共价结合到目的蛋白N端的Avi标签上,从而对目的蛋白进行生物素标记。同时,本质粒带有SUMO3标签,可被rSENP2蛋白酶特异性的识别并切割,从而实现相应标签蛋白与目的蛋白的高效分离。本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)抗性。

Avi标签是由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的短肽标签,在ATP和生物素存在的条件下,BirA可以在Avi标签的赖氨酸残基上连接一个生物素,从而实现目的蛋白的生物素标记[1]。

生物素连接酶BirA特异性生物素标记Avi-tag有多方面的优点。Avi标签小且对融合蛋白的影响非常小,只针对Avi标签上的Lys残基进行特定位置的生物素标记,生物素标记效率高,可重复性好;体内或体外均可进行标记,标记后的蛋白与链霉亲和素(Streptavidin)的亲和力高,从而使Avi-tag技术可以应用于目的蛋白的固定吸附、纯化和检测等;相比于传统生物素化学标记的非特异性位点的标记,BirA催化的反应条件更温和,对被标记蛋白活力影响小,酶活效率高,标记特异性强[1]。

类泛素蛋白修饰分子(Small ubiquitin-like modifier, SUMO),也被称为泛素样修饰因子小蛋白、泛素样小分子修饰因子或小泛素相关修饰物,是广泛存在于真核生物的蛋白家族。和泛素化(Ubiquitination)类似,类泛素蛋白修饰分子通过类泛素蛋白(Ubiquitin-like proteins, Ubls)活化酶(Ubl activating enzyme, E1)、结合酶(Ubl conjugating enzyme, E2)和连接酶(Ubl protein ligase, E3)共价连接到特定蛋白的赖氨酸上,这一过程被称为SUMO化修饰(SUMOylation)。SUMO化修饰是一种翻译后修饰,参与细胞的调控,如细胞核到细胞膜的运输、转录调控、细胞凋亡、蛋白质的稳定、压力应激和细胞周期的调控等[2]。

SUMO3标签源自人SUMO3基因,在大肠杆菌体系中SUMO3标签可以作为分子伴侣帮助目的蛋白在表达过程中正确折叠,提高目的蛋白的可溶性和表达量。SUMO3标签在体外可以被rSENP2蛋白酶特异性的识别并切割,从而实现SUMO3标签与目的蛋白的高效分离,切割后的目的蛋白不带有任何相应标签氨基酸的残留,因此SUMO3标签适用于大肠杆菌重组蛋白的表达和纯化[3]。

本质粒表达的目的蛋白可以采用如BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐还原螯合型) (P2210/P2218/P2220)His标签蛋白纯化试剂盒(耐还原螯合型) (P2226)以及BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型) (P2233)His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型) (P2229S)等进行纯化。

pET-N-His-SUMO3-Avi质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
T7 promoter 21-39
His tag 138-413
SUMO3 tag 138-413
Avi tag 417-461
Multiple Cloning Sites 468-492
His tag 508-525
T7 Terminator 592-639
f1 origin 676-1131
Ampicillin 1262-2122
ori 2293-2881
lacI 4311-5393

pET-N-His-SUMO3-Avi质粒(5759bp)的图谱如下:

pET-N-His-SUMO3-Av表达基因的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D3009 pET-N-His-SUMO3-Avi (Avi标签原核表达质粒).pdf

pET-N-His-SUMO3-Avi中没有的酶切位点包括:

AarI AatII AbsI Acc36I Acc65I AcvI AflII
AgeI AhlI AjuI AleI AscI AsiGI AsiSI
Asp718I AspA2I AsuNHI AvrII AxyI BaeI BalI
BanIII BbrPI BbvCI BcuI BfrI BfuAI BlnI
BmtI BplI BsaI Bsa29I BsaMI Bse21I BseCI
BshVI BshTI BsiWI BsmI Bso31I Bsp68I Bsp1407I
BspDI BspMI BspOI BspTI BspTNI BspXI BsrGI
Bst98I BstAFI BstAUI BstSNI Bsu15I Bsu36I BsuTUI
BtuMI BveI Cfr9I Cfr42I ClaI CpoI CsiI
CspI CspAI Eco31I Eco72I Eco81I Eco105I EcoT22I
FalI FauNDI FseI I-CeuI I-PpoI I-SceI KflI
KpnI KspI MabI MauBI MfeI MlsI MluNI
Mph1103I MreI MscI Msp20I MspCI MssI MunI
Mva1269I Nb.BbvCI Nb.BsmI Nb.Mva1269 NdeI NheI NruI
NsiI Nt.BbvCI OliI PacI PalAI PasI PctI
Pfl23II PI-PspI PI-SceI PinAI PmaCI PmeI PmlI
PspCI PspLI PsrI RgaI RigI RruI RsrII
Rsr2I SacII SanDI SbfI SdaI SexAI SfaAI
SfiI Sfr303I SgfI SgrBI SgrDI SgsI SmaI
SmiI SnaBI SpeI SrfI Sse8387I SspBI SstII
SwaI TspMI Vha464I XmaI XmaCI XmaJI ZraI
Zsp2I

pET-N-His-SUMO3-Avi中的单酶切位点包括:

AhdI GACNN,N`NNGTC 2049 HpaI GTT|AAC 4536
AlwNI CAG,NNN`CTG 2528 MluI A`CGCG,T 5038
ApaI G,GGCC`C 4835 NcoI C`CATG,G 106
AvaI C`YCGR,G 502 NotI GC`GGCC,GC 494
BamHI G`GATC,C 411 PaeR7I C`TCGA,G 502
BclI T`GATC,A 5024 PciI A`CATG,T 2937
BglII A`GATC,T 1 PflFI GACN`N,NGTC 3195
BmgBI CAC|GTC 389 PflMI CCAN,NNN`NTGG 5463
Bpu10I CC`TNA,GC 3832 PpuMI RG`GWC,CY 3932
BseRI GAGGAG 16/14 159 PshAI GACNN|NNGTC 4197
BsoBI C`YCGR,G 502 PsiI TTA|TAA 1034
BspQI GCTCTTCN`NNN, 3054 PspOMI G`GGCC,C 4831
BssHII G`CGCG,C 4627 PspXI VC`TCGA,GB 502
BstAPI GCAN,NNN`NTGC 5362 PstI C,TGCA`G 1807
BstBI TT`CG,AA 433 PvuI CG,AT`CG 1680
BstEII G`GTNAC,C 4856 SacI G,AGCT`C 478
BstZ17I GTA|TAC 3170 SalI G`TCGA,C 481
DraIII CAC,NNN`GTG 909 SapI GCTCTTCN`NNN, 3054
EagI C`GGCC,G 494 ScaI AGT|ACT 1568
Eco53kI GAG|CTC 476 SgrAI CR`CCGG,YG 5719
EcoNI CCTNN`N,NNAGG 5506 SphI G,CATG`C 5571
EcoRI G`AATT,C 468 StuI AGG|CCT 270
EcoRV GAT|ATC 4592 Tth111I GACN`N,NGTC 3195/td>
FspAI TGC|GCA 3960 XbaI T`CTAG,A 67
HindIII A`AGCT,T 487 XhoI C`TCGA,G 502

pET-N-His-SUMO3-Avi质粒中推荐使用的测序引物序列如下: T7-R (21-39): 5'-CCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'

pET-N-His-SUMO3-Avi的全序列信息:D3009 pET-N-His-SUMO3-Avi (Avi标签原核表达质粒)全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D3009-1µg pET-N-His-SUMO3-Avi 1µg
D3009-100µg pET-N-His-SUMO3-Avi 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转化。
3.本质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,构建的质粒可以用常规方法转入表达菌株。
参考文献:
1.Millard G.Cull, Peter J.Schatz. Methods in Enzymology. 2000. Volume 326:430-440.
2.Hay RT. Mol Cell. 2005. 18(1):1-12.
3.Marblestone et al., Protein Science.2006. 15:182-189.
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