Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法)
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产品编号 P0630L
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¥ 3868.00
产品包装:
20次 100次 500次
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碧云天研发的Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法)(Biotin Labeling Kit for Avi-tag Protein with BirA)是一种通过生物素连接酶(BirA)对Avi标签融合蛋白或多肽快捷、高效地进行生物素标记的试剂盒。生物素标记的蛋白可使用基于Streptavidin或Avidin方法进行纯化或检测,例如使用Streptavidin磁珠对生物素标记蛋白进行纯化,或用HRP等标记的Streptavidin对生物素标记蛋白进行检测。

本试剂盒中的生物素连接酶(Biotin-protein ligase, BirA)来源于E.coli,由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的重组蛋白,纯度高,活性强,没有额外的标签,不影响生物素标记蛋白的后续检测和纯化。BirA可在ATP存在的条件下,高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5’腺苷酸,并特异性地将生物素连接到Avi标签的赖氨酸残基上,从而对目的蛋白进行快捷、高效的生物素标记(图1)。

图1. 碧云天Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法)的原理图。

Avi标签是由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的短肽标签,在ATP和生物素存在的条件下,BirA在Avi标签的赖氨酸残基上连接一个生物素,从而实现目的蛋白的生物素标记[1]。生物素连接酶BirA特异性的生物素标记Avi标签有多方面的优点。Avi标签小且对融合蛋白的影响非常小,只针对Avi标签上的Lys残基进行特定位置的生物素标记,生物素标记效率高,可重复性好;体内或体外均可进行标记,标记后的蛋白与链霉亲和素(Streptavidin)的亲和力高,从而使Avi-tag技术可以应用于目的蛋白的固定吸附、纯化和检测等;相比于传统生物素化学标记的非特异性位点的标记,BirA催化的反应条件更温和、更简单,对被标记蛋白活力影响小,酶活效率高,标记特异性强[1]。

生物素(Biotin)与亲和素(Avidin)或链霉亲和素(Streptavidin)之间的非共价相互作用是已知的几乎是最强的蛋白-配体的相互作用[2]。Avidin或Streptavidin是一种4聚体蛋白,可以同时高度特异性地结合4个生物素分子,是一种天然存在的生物分子相互作用体系。生物素与Avidin或Streptavidin的结合系统,被称为生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素系统,该系统是一种具有高度亲和力、高灵敏度、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术,已广泛应用于多种检测系统[3]。

本试剂盒用于体外生物素标记Avi标签融合蛋白的效果参考图2。

图2. 碧云天的Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法)进行体外生物素标记Avi标签融合蛋白的效果图。在50μl反应体系中,加入相同量带有Avi标签的蛋白,及一定浓度的生物素连接酶(BirA),30℃孵育30分钟,反应完毕后加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) (P0015),使用BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Hepes, 4-15%, 10孔) (P0519)电泳。一份样品进行Western,使用辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303)孵育,检测Avi标签融合蛋白被生物素标记的效率(上图),Western印迹成像由BeyoImager™ 600化学发光成像系统(EI600)完成;另一份样品作为Input,使用BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)对Avi标签融合蛋白进行染色(下图)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

用于体外Avi标签蛋白的生物素标记反应时,按照20μl或50μl反应体系,蛋白(多肽)终浓度40μM计算,本产品小包装可以用于50或20个样品的标记,中包装可以用于250个或100个样品的标记,大包装可以用于1250个或500个样品的标记。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
P0630S-1 BirA (100X) 10μl
P0630S-2 Biotin Ligase Buffer A (10X) 100μl
P0630S-3 Biotin Ligase Buffer B (10X) 100μl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
P0630M-1 BirA (100X) 50μl
P0630M-2 Biotin Ligase Buffer A (10X) 0.5ml
P0630M-3 Biotin Ligase Buffer B (10X) 0.5ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
P0630L-1 BirA (100X) 50μl×5
P0630L-2 Biotin Ligase Buffer A (10X) 2.5ml
P0630L-3 Biotin Ligase Buffer B (10X) 2.5ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,一年有效。

注意事项:

建议首次解冻Biotin Ligase Buffer B (10X)后进行分装,反复冻融会影响组分活性。

BirA的用量、反应温度和时间等可根据不同实验预先进行适当摸索和优化,例如BirA的浓度可在0.2X-2X之间适当调整。

本产品的蛋白(多肽)底物为带有Avi标签的融合蛋白或多肽,碧云天提供一系列Avi标签的原核表达质粒:pET-N-His-Avi (D3002)pET-His-MCS-Avi (D3005)pET-N-Avi-His-SUMO3 (D3007),D3009 pET-N-His-SUMO3-Avi (D3009);真核表达质粒pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo (D2973)pCMV-N-3X Flag-Avi-SUMOEU1-Neo (D2975)pCMV-N-3X Flag-SUMOEU1-MCS-Avi (D2979)

反应溶液中的盐或试剂的终浓度有一定要求,如NaCl < 100mM,Glycerol < 5%,(NH4)2SO4 < 50mM,Tris < 50mM,否则会抑制生物素连接酶的活性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 体外生物素标记带有Avi标签的蛋白或多肽。
按照下表配制一个反应体系。轻轻吹打混匀后,30℃孵育30分钟,带有Avi标签的蛋白或多肽即可完成生物素标记。
Component Volume Final Concentration
Biotin Ligase Buffer A (10X) 5μl 1X
Biotin Ligase Buffer B (10X) 5μl 1X
BirA (100X) 0.5μl 1X
Protein or peptide Xμl 40μM
ddH2O To 50μl -
注1:本反应体系的体积可根据实际需要进行缩小或放大。很多情况下也可以设置为20μl的反应体系。
注2:蛋白(多肽)底物的反应终浓度通常不宜超过40μM。
注3:如果蛋白(多肽)底物的反应终浓度低于40μM,为保证生物素标记效果,需要适当延长反应时间,或增加BirA的用量,或对蛋白(多肽)底物进行浓缩以提高浓度。例如:蛋白(多肽)底物反应终浓度为20μM,可将反应时间延长至1小时;如果需要在30分钟使反应终浓度为20μM蛋白(多肽)底物几乎完全被生物素标记,则需要加入约2倍用量的BirA。
注4:如果蛋白(多肽)底物必须低温以维持活性,可将反应体系置于4℃,适当延长反应时间,并适当增加BirA的用量。
2. 生物素标记效率检测。
可以通过类似于Western blot的电泳和印迹检测实验进行检测,即在电泳、转膜后洗涤、封闭,随后与经过适当稀释的辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303)孵育,洗涤3-5次后,使用ECL类试剂(如P0018A BeyoECL Star等)通过化学发光成像来检测生物素标记效率。详细的Western操作可以参考碧云天的相关网页:http://www.beyotime.com/support/western.htm
3. 生物素标记的蛋白或多肽纯化。
推荐使用碧云天的BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (P2151)分离纯化生物素标记的蛋白或多肽。
参考文献:
1. Millard G.Cull, Peter J.Schatz. Methods in Enzymology. 2000. 326:430-440.
2. Fairhead M, Howarth M. Methods Mol Biol. 2015. 1266:171-84.
3. Diamandis EP, Christopoulos TK. Clin Chem. 1991. 37(5):625-36.
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产品编号 产品名称 包装
P0630S Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法) 20-50次
P0630M Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法) 100-250次
P0630L Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法) 500-1250次
A0303 辣根过氧化物酶标记Streptavidin 0.2ml
A0312 碱性磷酸酯酶标记Streptavidin 0.2ml
P2151-200μl BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠) 200μl
P2151-1ml BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠) 1ml
P2151-5ml BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠) 5ml
P0101 生物素检测封闭试剂盒 200次
P0015 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) 2ml
D2971-1μg pCMV-3X Flag-Avi-MCS-IRES-BirA 1μg
D2971-100μg pCMV-3X Flag-Avi-MCS-IRES-BirA 100μg
D2977-1μg pCMV-N-3X Flag-Avi-SUMOEU1-MCS-IRES-BirA (生物素标记质粒) 1μg
D2977-100μg pCMV-N-3X Flag-Avi-SUMOEU1-MCS-IRES-BirA (生物素标记质粒) 100μg
D2981-1μg pCMV-N-3X Flag-SUMOEU1-MCS-Avi-IRES-BirA (生物素标记质粒) 1μg
D2981-100μg pCMV-N-3X Flag-SUMOEU1-MCS-Avi-IRES-BirA (生物素标记质粒) 100μg
D3015-1μg pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA(生物素标记原核表达质粒) 1μg
D3015-100μg pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA(生物素标记原核表达质粒) 100μg
D3011-1μg pET-Dual-His-Avi-MCS-BirA (生物素标记原核表达质粒) 1μg
D3011-100μg pET-Dual-His-Avi-MCS-BirA (生物素标记原核表达质粒) 100μg
D3013-1μg pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA (生物素标记原核表达质粒) 1μg
D3013-100μg pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA (生物素标记原核表达质粒) 100μg
D3017-1μg pET-Dual-His-SUMO3-Avi-MCS-BirA(生物素标记原核表达质粒) 1μg
D3017-100μg pET-Dual-His-SUMO3-Avi-MCS-BirA(生物素标记原核表达质粒) 100μg
D3009-100μg pET-N-His-SUMO3-Avi (Avi标签原核表达质粒) 100μg
D3009-1μg pET-N-His-SUMO3-Avi (Avi标签原核表达质粒) 1μg
D3002-100μg pET-N-His-Avi (Avi标签原核表达质粒) 100μg
D3002-1μg pET-N-His-Avi (Avi标签原核表达质粒) 1μg
D3007-100μg pET-N-Avi-His-SUMO3 (Avi标签原核表达质粒) 100μg
D3007-1μg pET-N-Avi-His-SUMO3 (Avi标签原核表达质粒) 1μg
D3005-100μg pET-His-MCS-Avi (Avi标签原核表达质粒) 100μg
D3005-1μg pET-His-MCS-Avi (Avi标签原核表达质粒) 1μg
D2979-100μg pCMV-N-3X Flag-SUMOEU1-MCS-Avi (Avi标签质粒) 100μg
D2979-1μg pCMV-N-3X Flag-SUMOEU1-MCS-Avi (Avi标签质粒) 1μg
D2975-100μg pCMV-N-3X Flag-Avi-SUMOEU1-Neo (Avi标签质粒) 100μg
D2975-1μg pCMV-N-3X Flag-Avi-SUMOEU1-Neo (Avi标签质粒) 1μg
D2973-1μg pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo 1μg
D2973-100μg pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo 100μg
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