pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA (生物素标记原核表达质粒)
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产品编号 D3013-1μg
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¥ 888.00
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1μg 100μg
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pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA是碧云天自行研发的用于在大肠杆菌(E.coli)中表达生物素标记蛋白的质粒。该质粒带有两组T7启动子/lac操作子和核糖体结合位点(Ribosome binding site, RBS),其中一组的多克隆位点(Multiple cloning sites, MCS)位于His标签(His tag)和Avi标签(Avi tag)之间,另一组用于表达带有S标签(S tag)的生物素连接酶(Biotin ligase) BirA,因此都可以在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的蛋白和BirA的共表达。在ATP和生物素(Biotin)存在的条件下,细胞内表达BirA催化生物素共价结合到目的蛋白N端的Avi标签上,从而可以在表达目的蛋白的同时进行生物素标记。本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)抗性。

Avi标签是由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的短肽标签,在ATP和生物素存在的条件下,BirA可以在Avi标签的赖氨酸残基上连接一个生物素,从而实现目的蛋白的生物素标记[1]。

生物素连接酶BirA特异性生物素标记Avi-tag有多方面的优点。Avi标签小且对融合蛋白的影响非常小,只针对Avi标签上的Lys残基进行特定位置的生物素标记,生物素标记效率高,可重复性好;体内或体外均可进行标记,标记后的蛋白与链霉亲和素(Streptavidin)的亲和力高,从而使Avi-tag技术可以应用于目的蛋白的固定吸附、纯化和检测等;相比于传统生物素化学标记的非特异性位点的标记,BirA催化的反应条件更温和,对被标记蛋白活力影响小,酶活效率高,标记特异性强[1]。

本质粒表达的目的蛋白可以采用如BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐还原螯合型) (P2210/P2218/P2220)His标签蛋白纯化试剂盒(耐还原螯合型) (P2226)以及BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型) (P2233)His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型) (P2229S)等进行纯化。

pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
T7-1 promoter 6364-2
His tag 83-100
Multiple Cloning Sites 101-160
Avi tag 161-205
T7-2 promoter 262-280
BirA 351-1313
S tag 1326-1370
T7 Terminator 1422-1469
f1 origin 1506-1961
Ampicillin 2076-2936
ori 3110-3698
lacI 4891-5973

pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA质粒(6380bp)的图谱如下:

pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA表达基因的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D3013 pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA (生物素标记原核表达质粒).pdf

pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA中没有的酶切位点包括:

AatI AatII AbsI Acc65I AcvI AgeI AhlI
AjiI AleI AsiGI AsiSI Asp718I AsuII AsuNHI
BaeI BbrPI BcuI BglII BmgBI BmtI BoxI
BplI Bpu14I BshTI BsiWI Bsp68I Bsp119I BspOI
BspT104I BstBI BstPAI BstSNI BtrI BtuMI Cfr9I
Cfr42I CpoI CspI Csp45I CspAI CspCI Eco32I
Eco72I Eco105I Eco147I EcoRV EcoT22I FalI FseI
FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI KpnI KspI MabI
MauBI MfeI Mph1103I MreI MssI MunI NheI
NruI NsiI NspV OliI PceI Pfl23II PI-PspI
PI-SceI PinAI PmaCI PmeI PmlI PshAI PspCI
PspLI PsrI RgaI RigI RsrII Rsr2I SacII
SanDI SexAI SfaAI SfiI Sfr303I SfuI SgfI
SgrBI SgrDI SmaI SmiI SnaBI SpeI SrfI
SseBI SstII StuI SwaI TspMI XmaI XmaCI
ZraI Zsp2I

pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA中的单酶切位点包括:

AarI CACCTGCNNNN`NNNN, 1129 NcoI C`CATG,G 69
AflII A`CRYG,T 211 NdeI CA`TA,TG 346
AhdI GACNN,N`NNGTC 2149 NotI GC`GGCC,GC 150
AscI GG`CGCG,CC 125 PacI TTA,AT`TAA 1389
AvrII C`CTAG,G 1393 PaeR7I C`TCGA,G 1314
BamHI G`GATC,C 106 PasI CC`CWG,GG 434
BbvCI CC`TCA,GC 831 PciI A`CATG,T 3754
BlpI GC`TNA,GC 1411 PflFI GACN`N,NGTC 4012
BsmI GAATG,CN` 557 PpuMI RG`GWC,CY 4749
BspQI GCTCTTCN`NNN, 3871 PsiI A`CATG,T 1864
BsrGI T`GTAC,A 238 PspXI VC`TCGA,GB 1314
BstAPI GCAN,NNN`NTGC 5942 PvuI CG,AT`CG 2519
BstEII G`GTNAC,C 5436 SacI G,AGCT`C 122
BstZ17I GTA|TAC 3987 SalI G`TCGA,C 137
Bsu36I CC`TNA,GG 1296 SapI GCTCTTCN`NNN, 3871
DraIII CAC,NNN`GTG 1739 ScaI AGT|ACT 2629
Eco53kI GAG|CTC 120 SgrAI CR`CCGG,YG 6299
EcoRI G`AATT,C 112 SphI G,CATG`C 6151
FspI TGC|GCA 2371 SspI AAT|ATT 1944
HindIII A`AGCT,T 143 Tth111I GACN`N,NGTC 4012
HpaI GTT|AAC 5116 XbaI T`CTAG,A 30
MluI A`CGCG,T 5618 XhoI C`TCGA,G 1314

pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA质粒中推荐使用的测序引物序列如下: T7-R (262-281): 5'-CCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'

pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA的全序列信息:D3013 pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA (生物素标记原核表达质粒)全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D3013-1µg pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA 1µg
D3013-100µg pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转化。
3.本质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,构建的质粒可以用常规方法转入表达菌株。
参考文献:
1.Millard G.Cull, Peter J.Schatz. Methods in Enzymology. 2000. Volume 326:430-440.
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