碧云天的线粒体红色荧光染色试剂盒(Mito-Tracker Red CMXRos)，即Mitochondrial Red Fluorescence Staining Kit with Mito-Tracker Red CMXRos，也称Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with Mito-Tracker Red CMXRos，是基于线粒体红色荧光探针Mito-Tracker Red CMXRos用于活细胞线粒体特异性荧光染色或检测线粒体膜电位的试剂盒。本试剂盒适用于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等荧光检测设备。本试剂盒兼容后续的细胞固定和通透，但染色后再固定和通透，Mito-Tracker Red CMXRos的荧光强度会有一定程度的下降。

Mito-Tracker Red CMXRos (线粒体红色荧光探针)，也称MitoTracker Red CMXRos，是一种具有细胞通透性的X-rosamine衍生物(Chloromethyl-X-rosamine，简称CMXRos)，能够特异性地标记细胞中具有生物活性的线粒体，检测线粒体膜电位。本产品为高纯度高品质探针，兼容后续的细胞固定和通透，但染色后再固定和通透，荧光强度会有一定程度的下降。

本产品是一种氧化型的红色荧光染料，只需简单地和细胞孵育，即可通过被动运输穿过细胞膜，并借助本探针含有的弱巯基反应性的氯甲基(mildly thiol-reactive chloromethyl)官能团特异性地标记有生物活性的线粒体。本探针含有的弱巯基反应性的氯甲基，可以和线粒体内蛋白的巯基反应并共价连接，因此后续实验使用多聚甲醛或甲醛等醛类固定剂，以及细胞通透的去垢剂Triton X-100等处理时，线粒体的荧光标记不会消失，但可能会有一定程度的下降(约下降2-10倍)。由于本荧光探针的激发光谱和发射光谱与常见的绿色荧光探针重叠较少，因此非常适合用于荧光双标实验。

Mito-Tracker Red CMXRos分子式为C32H32Cl2N2O，分子量为531.5，CAS number为167095-09-2，Mito-Tracker Red CMXRos呈红色荧光，最大激发波长为579nm，最大发射波长为599nm。Mito-Tracker Red CMXRos的激发光谱和发射光谱以及结构式参考图1。

图1.Mito-Tracker Red CMXRos的激发光谱和发射光谱(A)以及结构式(B)。

Mito-Tracker Red CMXRos可以用作线粒体特异性的荧光探针[1]。和Rhodamine 123或JC-1相似，Mito-Tracker Red CMXRos对于线粒体的染色依赖于线粒体膜电位，因此该探针只能对活的细胞或组织进行染色，不能对固定或通透后的细胞或组织进行染色。使用Mito-Tracker Red CMXRos染色活细胞线粒体效果参考图2。

图2.碧云天线粒体红色荧光染色试剂盒(Mito-Tracker Red CMXRos) (C1999)对于HeLa细胞(人宫颈癌细胞)的染色效果图。经本试剂盒中Mito-Tracker Red CMXRos染色的HeLa活细胞线粒体呈现红色荧光(图B)，Hoechst 33342染色的HeLa细胞的细胞核呈蓝色荧光(图C)。FCCP处理15分钟后线粒体膜电位下降，线粒体红色荧光强度明显降低(图F)。线粒体红色荧光和细胞核蓝色荧光的叠加(Merge)效果见图D、H。本图仅作参考，实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异。

由于Mito-Tracker Red CMXRos在线粒体内的积累依赖于线粒体的膜电位，因此可以作为线粒体膜电位的指示探针，并可以通过检测线粒体膜电位的变化来检测细胞凋亡。

对于96孔板中的样品，按照每孔使用100μl染色液计算，本试剂盒的小包装和中包装可以进行500次和2000次检测；如果用于流式细胞仪检测，按照每个样品的检测体系体积为0.5ml时，本试剂盒的小包装和中包装可以进行100次和400次检测；对于6孔板中的贴壁培养细胞样品，按照每孔使用1ml染色液计算，本试剂盒的小包装和中包装可以进行50次和200次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C1999S-1	Mito-Tracker Red CMXRos (1000X)	50µl
C1999S-2	Hoechst 33342 (1000X)	50µl
C1999S-3	FCCP (1000X)	20µl
C1999S-4	Assay Buffer	120ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
C1999M-1	Mito-Tracker Red CMXRos (1000X)	200µl
C1999M-2	Hoechst 33342 (1000X)	200µl
C1999M-3	FCCP (1000X)	80µl
C1999M-4	Assay Buffer	500ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中Mito-Tracker Red CMXRos (1000X)和Hoechst 33342 (1000X)须避光保存。

注意事项：

Mito-Tracker Red CMXRos (1000X)反复冻融对于其检测效果有影响，请适当分装，避免反复冻融。

染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加以及线粒体形态发生显著变化。

本试剂盒可以用于活细胞的线粒体荧光标记，但不适合用于固定后细胞或者组织的染色；如需固定后标记，推荐线粒体绿色荧光染色试剂盒(Mito-Tracker Green) (C1996)。染色后再固定和通透，荧光强度会有一定的下降，建议提高Mito-Tracker Red CMXRos的浓度。如需进一步通透处理，推荐使用免疫染色通透液(Saponin) (P0095)。

对于微量的液体，每次使用前先离心数秒钟，使液体充分沉降到管底。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

需自备细胞培养板、盖玻片和载玻片等(可以向碧云天订购)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.染色工作液的配制。
对于6、12、24、96孔板，每孔所需的染色工作液(Working Solution)的用量分别为1ml、500μl、200μl和50-100μl。根据样品数量，计算所需检测工作液的体积。以12孔板每孔500μl染色工作液的体系为例，参考下表配制检测工作液。

Samples	1	5	10	20
Mito-Tracker Red CMXRos (1000X)	0.5μl	2.5μl	5μl	10μl
Hoechst 33342 (1000X)	0.5μl	2.5μl	5μl	10μl
Assay Buffer	499μl	2.495ml	4.99ml	9.98ml
Working Solution	500μl	2.5ml	5ml	10ml

注1：染色工作液需现用现配，并一次性使用完毕，不可冻存。
注2：染色工作液中的Mito-Tracker Red CMXRos (1000X)和Hoechst 33342 (1000X)的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化，上表中的用量为推荐用量，可以在0.2X-2X范围内摸索最佳工作浓度。
注3：本试剂盒中提供的Assay Buffer在一段时间内可以维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果通常比PBS或HBSS更好，也可以使用Assay Buffer外的其它合适的缓冲液，如含血清完全培养液、无血清培养液、HBSS (C0218)或PBS。
2. 阳性对照的设置。
把试剂盒中提供的FCCP (1000X)推荐按照1:1000的比例加入到细胞培养液中，处理细胞15分钟，对于大多数细胞，通常1X的 FCCP处理15-20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，具体处理时间可以根据细胞种类适当调整。随后按照下述步骤进行染色。
注1：仅在阳性对照孔内加入FCCP作为阳性对照，其余孔内不必加入FCCP。
注2：FCCP实测对于HeLa细胞有良好效果，但可能对某些细胞效果微弱或者完全没有效果。
3. 贴壁细胞的线粒体染色。
a.当细胞在培养板或培养皿中培养至适当密度时，根据实验需要进行适当处理，然后去除细胞培养液，加入步骤1中配制好的Mito-Tracker Red CMXRos染色工作液，37ºC孵育20-30分钟。注：最佳孵育时间需根据细胞类型进行适当的优化。
b.去除Mito-Tracker Red CMXRos染色工作液，加入适当体积的Assay Buffer或细胞培养液。
c.用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或荧光酶标仪进行观察或检测。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Red CMXRos染色工作液浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。
4.悬浮细胞的线粒体染色。
a.1000×g离心5分钟，弃上清，用37ºC预热的Mito-Tracker Red CMXRos染色工作液轻轻重悬细胞，37ºC孵育20-30分钟。
注：最佳孵育时间需根据细胞类型进行适当的优化。
b.孵育结束后，1000×g离心5分钟，弃上清，加入适当体积的Assay Buffer或细胞培养液。
c.用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪进行观察、分析或检测。
参考文献：
1.Liu Y, Liang J, Liu Z, Tian X, Sun C. Int J Biol Macromol. 2024. 265(Pt 1):130816.
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