碧云天生产的微管绿色荧光染色试剂盒(活性染色用)，Tubulin-Tracker Green Staining Kit for Living Cells，是一种使用了便捷灵敏的荧光探针Oregon Green 488 Taxol bis-acetate的活细胞微管绿色荧光染色试剂盒。本试剂盒除了荧光探针还提供了促溶剂、染色增强剂和稀释液，使荧光染色检测非常便捷。

Tubulin-Tracker Green探针是一种不带电荷的无荧光化合物，可轻松穿透活细胞的细胞膜。一旦进入细胞内，其亲脂性基团被细胞内的酯酶切除，就会变成带电荷的荧光形式，可以产生绿色荧光。

Tubulin-Tracker Green在活细胞内扩散快、灵敏度高、能够对细胞微管均匀染色，可使用荧光显微镜进行观察和检测。

Taxol, 即paclitaxel，中文名紫杉醇，是一类能够结合于微管的细胞骨架药物，具有一定的细胞毒性，可以抑制细胞的有丝分裂，该作用与其结合细胞内微管蛋白有关。Taxol可与聚合微管蛋白(polymerized tubulin)结合，结合后可促进微管聚合并稳定已聚合的微管，并将细胞周期阻滞于G2期和M期。所以需注意使用Tubulin-Tracker Green探针会抑制有丝分裂的进行，并可能影响依赖于聚合微管蛋白的其它功能。

本试剂盒中的Tubulin-Tracker Green是Oregon Green^® 488 Taxol (CAS号301844-13-3)的一种双乙酸酯修饰形式，更易进入细胞，荧光标记更均一，特异性也更好。

Tubulin-Tracker Green分子式为C₇₅H₆₉F₂N₂O₂₃，分子量约为1404，最大激发光波长为496nm，最大发射光波长为526nm。Tubulin-Tracker Green的化学结构式和光谱图参考图1。

Tubulin-Tracker Green只适用于对活细胞进行微管的荧光标记，不能对死细胞进行标记。使用本产品标记活细胞内微管的效果参考图2。

图2. Tubulin-Tracker Green (微管绿色荧光探针)对于NRK-52E细胞(大鼠肾小管上皮细胞)的染色效果。Tubulin-Tracker Green染色的NRK-52E细胞其微管呈现绿色荧光(图B)，Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)染色的NRK-52E细胞其线粒体呈现红色荧光(图C)，绿色荧光、红色荧光及细胞核蓝色荧光的叠加(merge)效果见图D。其中细胞核使用Hoechst 33342 (C1027)染色。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本产品中提供的促溶剂可以促进Tubulin-Tracker Green探针的溶解并改善染色效果；提供的染色增强剂(100X)是定位于活细胞膜上的阴离子转运蛋白的抑制剂，可降低去酯化的Tubulin-Tracker Green探针通过主动运输分泌到胞外；提供的Tubulin-Tracker Green稀释液使活细胞的微管荧光染色和洗涤更加便捷。

对于96孔板或6孔板，按照1:1000配制Tubulin-Tracker Green染色工作液，且每孔使用100μl或1ml Tubulin-Tracker Green染色工作液，本试剂盒分别可以进行200次或20次检测。

包装清单： 保存条件：

-20℃保存，至少半年有效，-80℃保存，至少一年有效。促溶剂和Tubulin-Tracker Green稀释液可以4℃保存。Tubulin-Tracker Green (1000X)需避光保存。

注意事项：

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

细胞在含染色增强剂(1X)的溶液中孵育的时间不能超过2小时。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.Tubulin-Tracker Green (500X)中间贮存液的准备：
融解并取出适当体积的Tubulin-Tracker Green (1000X)，加入等体积的促溶剂，即为Tubulin-Tracker Green (500X)中间贮存液。Tubulin-Tracker Green (500X)中间贮存液密封避光保存于-20℃两周内有效。
2.Tubulin-Tracker Green染色工作液的配制：对于6、12、24、96孔板，每孔所需的Tubulin-Tracker Green染色工作液的用量分别为1~2ml、0.5~1ml、200~500μl和100μl。根据样品数量，计算所需Tubulin-Tracker Green染色工作液的体积。以12孔板每孔1ml染色工作液的体系为例，参考下表配制Tubulin-Tracker Green染色工作液。
注1：Tubulin-Tracker Green染色工作液使用前需37℃预温育。
注2：Tubulin-Tracker Green染色工作液中的Tubulin-Tracker Green的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。Tubulin-Tracker Green的推荐工作浓度为1X，可以在0.5X-2X范围内摸索最佳工作浓度。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的Tubulin-Tracker Green。
注3：本试剂盒中提供的Tubulin-Tracker Green稀释液在一段时间内可以维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果通常比PBS或HBSS更好，也可以用其它合适的溶液，如无血清培养液代替。
3.活细胞微管的荧光标记：
a.去除细胞培养液，用适量的溶液如HBSS (C0218/C0219)或PBS (C0221A)洗涤生长在孔板、培养皿或爬片上的细胞。注：对于悬浮细胞的染色可以参考贴壁细胞的染色方法进行。
b.去除洗涤液，加入步骤2配制好的并37℃预温育的Tubulin-Tracker Green染色工作液，与细胞37℃共孵育30-120分钟，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。以30分钟作为初始孵育时间，根据所用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳效果。
c.去除Tubulin-Tracker Green染色工作液，用含染色增强剂 (1X)的Tubulin-Tracker Green稀释液洗涤细胞2-3次。
d.用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察(Tubulin-Tracker Green为绿色荧光，Ex/Em = 496/526nm，设置与FITC或GFP相同)，此时可观察到微管呈清晰的绿色荧光染色。注：染色完毕后应立即观察，放置时间过长会导致荧光强度减弱。
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