线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red)
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产品编号 S0061S
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¥ 799.00
产品包装:
20-200次 100-1000次
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碧云天生产的线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (Mitochondrial Superoxide Assay Kit with MitoSOX Red)是一种以MitoSOX Red为荧光探针,快速灵敏地检测线粒体内超氧化物变化的试剂盒。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。

超氧化物通常指超氧化物阴离子(Superoxide anion) O2·-,是一种氧分子的自由基。在呼吸链中,NADPH氧化酶把电子传递给氧分子的时候,就会产生超氧化物阴离子O2·-。超氧化物阴离子O2·-是一种强氧化剂,可以由被刺激的白细胞等产生,从而抵御微生物的感染等。超氧化物阴离子O2·-也可以导致氧化损伤,和许多疾病的发生密切相关[1-3]。

MitoSOX Red,简称MSR,也称MitoSOX、Mito-HE,分子量为759.7,分子式为C43H43IN3P,是一种新型的用于线粒体内超氧化物检测的荧光探针,其可快速、特异性地靶向线粒体,从而有选择性地检测线粒体内的超氧化物。MitoSOX Red是带有阳离子三苯基磷酸基团的二氢乙锭衍生物。二氢乙锭(Hydroethidine, HE)可以被活性物质(如超氧化物)氧化为乙锭,然后与DNA结合产生荧光。MitoSOX Red显示出同样的特性,可被超氧化物迅速氧化,但不被其它活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species, RNS)氧化,氧化产物结合核酸后,产生强荧光[4-6]。

本试剂盒检测线粒体内超氧化物的原理如图1所示。MitoSOX Red的磷酸基团上的正电荷被三个亲脂苯基包围,从而有助于其进入活细胞并选择性地靶向进入线粒体,最终可以被超氧化物氧化。被氧化的MitoSOX Red与线粒体内核酸结合,产生强烈的红色荧光,激发波长为510nm,发射波长为580nm。

图1.碧云天线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (S0061)检测原理图。

本试剂盒提供的MitoSOX Red为5mM储存液。本试剂盒推荐的最终使用浓度经过优化,对大多数细胞都适用,但为了得到更满意的结果,对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索,MitoSOX Red的终浓度通常为1-5μM,最优先的推荐终浓度为5μM。过量MitoSOX Red在线粒体积累会造成细胞损伤,因此MitoSOX Red的工作浓度不能超过5μM,否则可能会产生细胞毒性,例如改变线粒体形态,MitoSOX Red重新分布到胞核或胞质中等。同时,本试剂盒提供的mSoxUp作为诱导细胞线粒体内超氧化物生成的阳性对照,终浓度通常为0.5-2X,最优先的推荐终浓度为1X。使用本试剂盒检测细胞线粒体内超氧化物的效果参考图2。

图2.碧云天线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (S0061)检测L929细胞(小鼠成纤维细胞)线粒体内超氧化物的效果图。L929细胞不处理或用阳性对照试剂mSoxUp处理后,使用本试剂盒和Hoechst 33342以及Mito-Tracker Green进行染色。正常的L929细胞中未氧化MitoSOX Red,细胞中红色荧光非常弱,几乎观察不到红色荧光;使用诱导线粒体内超氧化物生成的阳性对照试剂mSoxUp处理后,线粒体内超氧化物生成增加,MitoSOX Red与超氧化物反应并重新分布,与线粒体及细胞核DNA结合,细胞中线粒体及细胞核的红色荧光显著增强[7]。蓝色荧光为Hoechst 33342标记的所有细胞的细胞核。绿色荧光为Mito-Tracker Green标记的所有细胞的线粒体。本试剂盒中不提供Hoechst 33342和Mito-Tracker Green,如有需要,可向碧云天订购Hoechst 33342染色液(C1022-C1029)、Mito-Tracker Green (C1048)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中效果仅供参考。

本试剂盒小包装和中包装,MitoSOX Red (5mM)按照1:1000的比例稀释,6孔板每孔检测体系为1ml时,可以分别进行20和100次检测;96孔板每孔检测体系为100μl时,可以分别检测200和1000次。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
S0061S-1 MitoSOX Red (5mM) 20µl
S0061S-2 mSoxUp (1000X) 20µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
S0061M-1 MitoSOX Red (5mM) 100µl
S0061M-2 mSoxUp (1000X) 50µl
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。MitoSOX Red (5mM)须避光保存,-80ºC保存效果更好。

注意事项:

BSA和酚红(Phenol red)对本荧光探针的检测有干扰,需避免。

荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。

根据文献报道,MitoSOX Red在与超氧化物反应后可能会重新分布,并与线粒体或细胞核DNA结合[7],因此可以观察到红色荧光集中在细胞核。

本试剂盒仅限于进行存活的细胞或组织的检测,不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板,推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(FCP965)。

第一次使用时请分装成小包装后-20ºC保存,以避免反复冻融。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.MitoSOX Red染色工作液的配制:
6孔板每孔所需MitoSOX Red染色工作液的量为1ml,其它培养器皿的MitoSOX Red染色工作液的用量以此类推;对于细胞悬液每50-100万细胞需0.5ml MitoSOX Red染色工作液。取适量MitoSOX Red (5mM),按照每1µl MitoSOX Red (5mM)加入1ml PBS (C0221A)的比例稀释MitoSOX Red,混匀后即为MitoSOX Red染色工作液。
注1:配制MitoSOX Red染色工作液时注意避光,且须现配现用,稀释后不能长期保存。
注2:MitoSOX Red染色工作液中MitoSOX Red的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。MitoSOX Red的推荐工作浓度为5μM,可以在1-5μM范围内摸索最佳工作浓度。
2.阳性对照的设置:
把试剂盒中提供的mSoxUp (1000X)推荐按照1:1000的比例加入到细胞培养液中,处理细胞4小时。随后按照下述方法加入MitoSOX Red染色工作液,进行线粒体内超氧化物的检测。对于大多数细胞,通常mSoxUp (1X)处理4小时后超氧化物含量大量增加,MitoSOX Red染色后观察应呈现较强的红色荧光;而正常的细胞经MitoSOX Red染色后应呈现微弱的红色荧光。对于特定的细胞,mSoxUp作用浓度和作用时间可能有所不同,需自行摸索最佳工作浓度作用时间,甚至某些细胞可能对mSoxUp不敏感。
3.对于悬浮细胞:
a.细胞按照实验设计进行一定处理后,酌情取约10-100万细胞600×g室温离心5分钟,弃上清,加入适当体积的MitoSOX Red染色工作液重悬细胞,使细胞密度为100万-1000万/ml。
b.细胞培养箱中37ºC孵育10-30分钟,不同的细胞最佳孵育时间不同。以15分钟作为初始孵育时间,根据作用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
c.37ºC孵育结束后,600×g 4ºC离心3-4分钟,沉淀细胞。弃上清,注意尽量不要吸除细胞。
d.用PBS洗涤2次:加入1ml PBS重悬细胞,600×g 4ºC离心3-4分钟,弃上清。再加入1ml PBS重悬细胞,600×g 4ºC离心3-4分钟,弃上清。
e.再用适量PBS重悬细胞后,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察,也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
4.对于贴壁细胞:
注:对于贴壁细胞,如果希望采用流式细胞仪检测,可以先消化并收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
a.对于6孔板的一个孔,吸除培养液,根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次。如果使用其它的多孔板,各种试剂的用量需要相应按比例调整。
b.加入1ml MitoSOX Red染色工作液。细胞培养箱中37ºC孵育10-30分钟,不同的细胞最佳孵育时间不同。以15分钟作为初始孵育时间,根据作用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
c.37ºC孵育结束后,吸除上清,用PBS洗涤2次。
d.加入2ml PBS,荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。如果考虑使用荧光酶标仪检测,优先推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(FCP965),分别进行顶读或底读模式进行荧光检测。
5.参数设置:
使用510nm激发波长,580nm发射波长,实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。MitoSOX Red和超氧化物反应产物的荧光光谱和碘化丙啶(PI)或Cy3丙非常相似,可以用检测Phycoerythrin (PE)的参数设置进行检测。
6.其它说明:
上述推荐的MitoSOX Red的工作浓度为5μM,对于某些细胞,如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照1:2000-1:5000的比例稀释MitoSOX Red,使装载探针时MitoSOX Red的浓度为1-2.5μM。另外,探针装载的时间也可以根据情况适当进行调整。
参考文献:
1.Shchepinova MM, Cairns AG, Prime TA, Logan A, James AM, et al. Cell Chem Biol. 2017. 24(10):1285-1298. e12.
2.Holmström KM, Finkel T. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014. 15(6):411-421.
3.Fridovich I. Aging Cell. 2004. 3(1):13-16.
4.Kauffman ME, Kauffman MK, Traore K, Zhu H, Trush MA, et al. React Oxyg Species (Apex). 2016. 2(5):361-370.
5.Robinson KM, Janes MS, Pehar M, Monette JS, Ross MF, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. 103(41):15038-15043.
6.Robinson KM, Janes MS, Beckman JS. Nat Protoc. 2008. 3(6):941-947.
7.Johnson-Cadwell L I, Jekabsons M B, Wang A, et al. J Neurochem. 2007. 101(6): 1619-1631.
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