碧云天生产的线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (Mitochondrial Superoxide Assay Kit with MitoSOX Red)是一种以MitoSOX Red为荧光探针，快速灵敏地检测线粒体内超氧化物变化的试剂盒。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。

超氧化物通常指超氧化物阴离子(Superoxide anion) O2·-，是一种氧分子的自由基。在呼吸链中，NADPH氧化酶把电子传递给氧分子的时候，就会产生超氧化物阴离子O2·-。超氧化物阴离子O2·-是一种强氧化剂，可以由被刺激的白细胞等产生，从而抵御微生物的感染等。超氧化物阴离子O2·-也可以导致氧化损伤，和许多疾病的发生密切相关[1-3]。

MitoSOX Red，简称MSR，也称MitoSOX、Mito-HE，分子量为759.7，分子式为C43H43IN3P，是一种新型的用于线粒体内超氧化物检测的荧光探针，其可快速、特异性地靶向线粒体，从而有选择性地检测线粒体内的超氧化物。MitoSOX Red是带有阳离子三苯基磷酸基团的二氢乙锭衍生物。二氢乙锭(Hydroethidine, HE)可以被活性物质(如超氧化物)氧化为乙锭，然后与DNA结合产生荧光。MitoSOX Red显示出同样的特性，可被超氧化物迅速氧化，但不被其它活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species, RNS)氧化，氧化产物结合核酸后，产生强荧光[4-6]。

本试剂盒检测线粒体内超氧化物的原理如图1所示。MitoSOX Red的磷酸基团上的正电荷被三个亲脂苯基包围，从而有助于其进入活细胞并选择性地靶向进入线粒体，最终可以被超氧化物氧化。被氧化的MitoSOX Red与线粒体内核酸结合，产生强烈的红色荧光，MitoSOX Red有两个激发峰，分别约为396nm和510nm，发射波长约为580nm。396nm的激发峰在其它活性氧(ROS)产生的乙锭类氧化产物的激发光谱中不存在，因此选择在396nm进行激发，可能对于线粒体超氧化物的检测更为特异[5-6]。

图1.碧云天线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (S0061)检测原理图。

本试剂盒提供的MitoSOX Red为5mM储存液。本试剂盒推荐的最终使用浓度经过优化，对大多数细胞都适用，但为了得到更满意的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，MitoSOX Red的终浓度通常为1-5μM，最优先的推荐终浓度为5μM。过量MitoSOX Red在线粒体积累会造成细胞损伤，因此MitoSOX Red的工作浓度不能超过5μM，否则可能会产生细胞毒性，例如改变线粒体形态，MitoSOX Red重新分布到胞核或胞质中等。同时，本试剂盒提供的mSoxUp作为诱导细胞线粒体内超氧化物生成的阳性对照，终浓度通常为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X。使用本试剂盒检测细胞线粒体内超氧化物的效果参考图2和图3。

图2.碧云天线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (S0061)检测L929细胞(小鼠成纤维细胞)线粒体内超氧化物的荧光显微镜效果图。L929细胞不处理或用阳性对照试剂mSoxUp处理后，使用本试剂盒和Hoechst 33342以及Mito-Tracker Green进行染色。正常的L929细胞中未氧化MitoSOX Red，细胞中红色荧光非常弱，几乎观察不到红色荧光；使用诱导线粒体内超氧化物生成的阳性对照试剂mSoxUp处理后，线粒体内超氧化物生成增加，MitoSOX Red与超氧化物反应并重新分布，与线粒体及细胞核DNA结合，细胞中线粒体及细胞核的红色荧光显著增强[7]。蓝色荧光为Hoechst 33342标记的所有细胞的细胞核。绿色荧光为Mito-Tracker Green标记的所有细胞的线粒体。本试剂盒中不提供Hoechst 33342和Mito-Tracker Green，如有需要，可向碧云天订购Hoechst 33342染色液(C1022-C1029)、Mito-Tracker Green (C1048)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

图3. 碧云天线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (S0061)检测L929细胞(小鼠成纤维细胞)线粒体内超氧化物的流式细胞术效果图。L929细胞不处理或用阳性对照试剂mSoxUp处理后，使用本试剂盒进行染色并进行流式细胞术检测。正常的L929细胞中未氧化MitoSOX Red，细胞中红色荧光非常弱；使用诱导线粒体内超氧化物生成的阳性对照试剂mSoxUp处理后，线粒体内超氧化物生成增加，细胞中的红色荧光显著增强。分别通过PE (Ex/Em=561/585)和Violet610 (Ex/Em=405/610)通道进行检测，Violet610通道信号更强一些但对照组的背景信号也更强一些，此时可能具有更好的特异性。参考细胞的荧光照片，类似的PE (Ex/Em=561/585)通道进行检测，此时具有更好的信噪比。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒小包装和中包装，MitoSOX Red (5mM)按照1:1000的比例稀释，6孔板每孔检测体系为1ml时，可以分别进行20和100次检测；96孔板每孔检测体系为100μl时，可以分别检测200和1000次。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0061S-1	MitoSOX Red (5mM)	20µl
S0061S-2	mSoxUp (1000X)	20µl
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
S0061M-1	MitoSOX Red (5mM)	100µl
S0061M-2	mSoxUp (1000X)	50µl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。MitoSOX Red (5mM)须避光保存，-80ºC保存效果更好。

注意事项：

BSA和酚红(Phenol red)对本荧光探针的检测有干扰，需避免。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

根据文献报道，MitoSOX Red在与超氧化物反应后可能会重新分布，并与线粒体或细胞核DNA结合[7]，因此可以观察到红色荧光集中在细胞核。

本试剂盒仅限于进行存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(FCP965)。

第一次使用时请分装成小包装后-20ºC保存，以避免反复冻融。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.MitoSOX Red染色工作液的配制：
6孔板每孔所需MitoSOX Red染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的MitoSOX Red染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50-100万细胞需0.5ml MitoSOX Red染色工作液。取适量MitoSOX Red (5mM)，按照每1µl MitoSOX Red (5mM)加入1ml PBS (C0221A)的比例稀释MitoSOX Red，混匀后即为MitoSOX Red染色工作液。
注1：配制MitoSOX Red染色工作液时注意避光，且须现配现用，稀释后不能长期保存。
注2：MitoSOX Red染色工作液中MitoSOX Red的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。MitoSOX Red的推荐工作浓度为5μM，可以在1-5μM范围内摸索最佳工作浓度。
2.阳性对照的设置：
把试剂盒中提供的mSoxUp (1000X)推荐按照1:1000的比例加入到细胞培养液中，处理细胞4小时。随后按照下述方法加入MitoSOX Red染色工作液，进行线粒体内超氧化物的检测。对于大多数细胞，通常mSoxUp (1X)处理4小时后超氧化物含量大量增加，MitoSOX Red染色后观察应呈现较强的红色荧光；而正常的细胞经MitoSOX Red染色后应呈现微弱的红色荧光。对于特定的细胞，mSoxUp作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度作用时间，甚至某些细胞可能对mSoxUp不敏感。
3.对于悬浮细胞：
a.细胞按照实验设计进行一定处理后，酌情取约10-100万细胞600×g室温离心5分钟，弃上清，加入适当体积的MitoSOX Red染色工作液重悬细胞，使细胞密度为100万-1000万/ml。
b.细胞培养箱中37ºC孵育10-30分钟，不同的细胞最佳孵育时间不同。以15分钟作为初始孵育时间，根据作用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
c.37ºC孵育结束后，600×g 4ºC离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
d.用PBS洗涤2次：加入1ml PBS重悬细胞，600×g 4ºC离心3-4分钟，弃上清。再加入1ml PBS重悬细胞，600×g 4ºC离心3-4分钟，弃上清。
e.再用适量PBS重悬细胞后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
4.对于贴壁细胞：
注：对于贴壁细胞，如果希望采用流式细胞仪检测，可以先消化并收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
a.对于6孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次。如果使用其它的多孔板，各种试剂的用量需要相应按比例调整。
b.加入1ml MitoSOX Red染色工作液。细胞培养箱中37ºC孵育10-30分钟，不同的细胞最佳孵育时间不同。以15分钟作为初始孵育时间，根据作用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
c.37ºC孵育结束后，吸除上清，用PBS洗涤2次。
d.加入2ml PBS，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。如果考虑使用荧光酶标仪检测，优先推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(FCP965)，分别进行顶读或底读模式进行荧光检测。
5.参数设置：
MitoSOX Red和超氧化物反应产物的荧光光谱，如果用于流式细胞仪或共聚焦显微镜检测，可以使用396nm激发波长、610nm发射波长进行检测，对于超氧化物的检测更精准，可以实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。流式细胞仪可以用Violet610 (Ex/Em=405/610)通道进行检测。对于普通的荧光显微镜，也可以使用510nm激发波长、580nm发射波长进行检测，但可能也可以检测到其它的活性氧。
6.其它说明：
上述推荐的MitoSOX Red的工作浓度为5μM，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000的比例稀释MitoSOX Red，使装载探针时MitoSOX Red的浓度为1-2.5μM。另外，探针装载的时间也可以根据情况适当进行调整。
参考文献：
1.Shchepinova MM, Cairns AG, Prime TA, Logan A, James AM, et al. Cell Chem Biol. 2017. 24(10):1285-1298. e12.
2.Holmström KM, Finkel T. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014. 15(6):411-421.
3.Fridovich I. Aging Cell. 2004. 3(1):13-16.
4.Kauffman ME, Kauffman MK, Traore K, Zhu H, Trush MA, et al. React Oxyg Species (Apex). 2016. 2(5):361-370.
5.Robinson KM, Janes MS, Pehar M, Monette JS, Ross MF, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. 103(41):15038-15043.
6.Robinson KM, Janes MS, Beckman JS. Nat Protoc. 2008. 3(6):941-947.
7.Johnson-Cadwell L I, Jekabsons M B, Wang A, et al. J Neurochem. 2007. 101(6): 1619-1631.
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产品编号	产品名称	包装
C1022	Hoechst 33342	10mg
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