碧云天的脂滴蓝色荧光检测试剂盒(LipiD-Blue)，英文名为Lipid Droplet Blue Fluorescence Assay Kit with LipiD-Blue，也称LipiD-Blue Staining Kit或Blue Neutral Lipid Stain，是一种基于新型荧光探针LipiD-Blue来检测细胞内脂滴(Lipid droplets)的试剂盒。本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统。

脂滴是由磷脂单分子层及甘油三酯(Triglyceride)、胆固醇酯(Cholesteryl ester)组成的中性脂肪(Neutral lipid)疏水核心构成，广泛存在于动物、细菌、酵母、植物和昆虫细胞中[1]。脂滴能够沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器相互作用，在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解、以及信号传导过程中起着重要的作用。多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病和Niemann Pick C疾病等，可能都伴随着脂质贮存的异常[2]。

本试剂盒所使用的荧光探针为LipiD-Blue，也称Lipi-Blue，是一种亲脂性染料，适用于脂滴的标记和成像。LipiD-Blue具有良好的光稳定性和适宜的荧光光谱，可与多种常用荧光染料(如GFP和AF555等)兼容，支持多色成像的需求。此外，LipiD-Blue同时适用于固定的细胞和活细胞，并具有较低背景。

LipiD-Blue在细胞中最大激发光波长约为385nm，最大发射光波长约为423nm。LipiD-Blue在NRK-52E细胞中的激发光和发射光光谱参考图1。

图1.LipiD-Blue在NRK-52E细胞中的激发光和发射光光谱。

本试剂盒提供的LipiD-Blue为1000X溶液，该溶液经过优化，对大多数细胞都适用，但为了得到满意的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，LipiD-Blue的终浓度通常为0.5X-5X，最优先的推荐终浓度为1X。本试剂盒提供了绿色细胞核染料Nuclear Green LCS，可染色活细胞或固定后的细胞，方便观察所有的细胞核，Nuclear Green LCS的最大激发波长约510nm，最大发射波长约为535nm。

LipiD-Blue在水和其它极性溶剂中几乎无任何荧光，一旦与甘油三酯等中性脂肪结合，便发出明亮的蓝色荧光。使用本试剂盒检测细胞内脂滴的效果请参考图2。

图2.碧云天脂滴蓝色荧光检测试剂盒(LipiD-Blue) (C2052)检测NRK-52E细胞内脂滴的效果图。图A为正常NRK-52E细胞在显微镜明场下的形态，正常细胞内无明显的脂滴聚集现象，因此经LipiD-Blue (图B)染色后呈较弱的荧光，主要为散在的微小脂滴染色；图E为使用400µM油酸(Oleic acid) (ST2053)诱导24小时后细胞在显微镜明场下形态，此时细胞内有很明显的脂滴聚集，脂滴经过LipiD-Blue染色后，呈现非常明亮的蓝色荧光(图F)。图C和图G呈现了细胞核Nuclear Green LCS的染色效果，图D、H为LipiD-Blue和Nuclear Green LCS荧光染色的叠加图。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

本试剂盒染色细胞后用于流式检测的效果请参考图3。

图3.碧云天脂滴蓝色荧光检测试剂盒(LipiD-Blue) (C2052)用于流式细胞仪检测的效果图。HeLa细胞经400µM油酸诱导24小时后，使用本试剂盒中的LipiD-Blue进行染色并进行流式检测。灰色峰为LipiD-Blue弱染色的HeLa细胞(同样经400µM油酸诱导24小时但未诱导形成明显脂滴的细胞)，蓝色峰为LipiD-Blue强染色的HeLa细胞(同样经400µM油酸诱导24小时但诱导形成明显脂滴的细胞)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

对于96孔板中的样品，按照每孔使用100μl染色液计算，本试剂盒小包装和中包装分别可以进行1000次和5000次检测；如果用于流式细胞仪检测，按照每个样品的检测体系体积为0.5ml时，本试剂盒小包装和中包装分别可以进行200次和1000次检测；对于6孔板中的贴壁培养细胞样品，按照每孔使用1ml染色液计算，本试剂盒小包装和中包装分别可以进行100次和500次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C2052S-1	LipiD-Blue (1000X)	0.1ml
C2052S-2	Nuclear Green LCS (1000X)	0.1ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
C2052M-1	LipiD-Blue (1000X)	0.5ml
C2052M-2	Nuclear Green LCS (1000X)	0.5ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，至少一年有效。LipiD-Blue (1000X)和Nuclear Green LCS (1000X)须避光保存。

注意事项：

第一次使用时LipiD-Blue (1000X)和Nuclear Green LCS (1000X)建议适当分装，避免反复冻融。

LipiD-Blue的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等可根据所使用的细胞进行适当摸索和优化，例如LipiD-Blue的浓度对于细胞染色可在0.5X-5X之间适当调整，对于流式细胞仪检测可在0.1X-1X之间适当调整。

LipiD-Blue在激光照射下易发生淬灭，因此需要在保证荧光亮度的前提下尽可能降低染料使用浓度，降低荧光显微镜激发光强度，缩短拍照时间。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.染色液的配制。
按照6孔板每孔1ml脂滴染色液的体系，参考下表配制适量的染色液，并充分混匀。

Reagent	1 Sample	10 Samples	100 Samples
LipiD-Blue (1000X)	1μl	10μl	100μl
Nuclear Green LCS (1000X)	1μl	10μl	100μl
Assay Buffer	998μl	9.98ml	99.8ml
Staining Solution	1ml	10ml	100ml

注1：配制好的Staining Solution必须一次使用完毕，不建议冻存或4ºC保存后继续使用。
注2：对于活细胞染色，建议使用含血清的培养液作为Assay Buffer；对于固定细胞染色，可使用PBS (C0221A)作为Assay Buffer。Assay Buffer可能会对染色结果有一定影响，可根据具体实验情况进行一定的摸索或优化。染色液中LipiD-Blue的浓度对于细胞染色可在0.5X-5X之间适当调整，对于流式细胞仪检测可在0.1X-1X之间适当调整。
注3：Nuclear Green LCS染色为可选。
2.荧光显微镜检测。
a.接种培养。将细胞接种于6孔板等多孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上。如有必要，按实验设计对细胞进行一定处理。
b.固定(选做)。
(a)取出待检测的细胞，使用PBS洗涤两遍，吸除PBS。
(b)加入4%多聚甲醛固定液(P0099)室温固定10-15分钟。
注1：LipiD-Blue和Nuclear Green LCS都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。
注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解细胞膜的去垢剂如含Saponin (P0095)或Digitonin (ST1272)的通透液，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。
c.染色。
(a)取出待检测的细胞，PBS洗涤1-2遍。
(b)吸除PBS，加入适当体积的Staining Solution，通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37ºC下避光孵育30分钟。
(c)PBS洗涤两遍。
d.检测。LipiD-Blue为蓝色荧光，最大激发光波长约为385nm，最大发射光波长约为423nm。Nuclear Green LCS为绿色荧光，最大激发波长约510nm，最大发射波长约为535nm。
注：使用荧光显微镜拍照时，为了减少荧光淬灭，尽可能降低荧光显微镜的激发光强度，缩短拍照时间。
3.流式细胞仪检测。
a.细胞准备。
(a)贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤一次；悬浮细胞250-1000×g室温离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤一次。每个样品推荐的细胞用量为106个细胞。
(b)400×g室温离心5分钟，弃上清。
b.固定(选做)。
(a)加入4%多聚甲醛固定液(P0099)，轻轻吹打重悬为单细胞悬液，室温固定10-15分钟。
(b)固定结束后，400×g室温离心5分钟，弃上清。
(c)加入0.5ml PBS后缓慢用移液器吹打洗涤，然后400×g室温离心5分钟，弃上清。
注1：LipiD-Blue和Nuclear Green LCS都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。
注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解细胞膜的去垢剂如含Saponin (P0095)或Digitonin (ST1272)的通透液，或BeyoFC™流式检测细胞通透与洗涤液(Saponin) (C1717)，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。
c.染色。
(a)对于上一步骤的细胞沉淀，除背景对照管外，其余每管加入0.5ml Staining Solution，轻柔并充分重悬细胞，37ºC避光孵育30分钟。
(b)400×g室温离心5分钟，弃上清。
(c)每孔加入0.5ml PBS后缓慢用移液器吹打洗涤，然后400×g室温离心5分钟，弃上清。
(d)每孔加入0.5ml PBS重悬细胞。
d.检测。检测时参考LipiD-Blue光谱特征选择合适的检测条件，例如Ex/Em=385/423nm。Nuclear Green LCS的Ex/Em=510/535nm。
注1：使用仅含Assay Buffer并且未经染色的细胞样品用于流式细胞仪的阴性对照设置。
注2：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对LipiD-Blue的稀释倍数进行适当调整。
4.荧光酶标仪检测。
a.接种培养。将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，如BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)，每孔的细胞数需要控制在100-10,000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理。
注：细胞数目可根据荧光强度进行调整。细胞也可接种于其他细胞培养板中，经胰酶消化后收集，用于后续实验。
b.固定(选做)。
(a)取出待检测的细胞，使用PBS洗涤两遍，吸除PBS。
(b)加入4%多聚甲醛固定液(P0099)室温固定10-15分钟。
注1：LipiD-Blue和Nuclear Green LCS都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。
注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解细胞膜的去垢剂如含Saponin (P0095)或Digitonin (ST1272)的通透液，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。
c.染色。
(a)取出待检测的细胞，使用PBS洗涤1-2遍。
(b)吸除PBS，加入适当体积的Staining Solution，通常96孔板每孔加入100μl。37ºC下避光孵育30分钟。
(c)PBS洗涤两遍。
d.检测。参考LipiD-Blue光谱特征，选取合适的波长进行读板，例如Ex/Em=385/423nm。具体根据酶标仪的特点选择，也不一定需要选用最大激发光/发射光波长来检测。Nuclear Green LCS的Ex/Em=510/535nm。
5.阳性对照的诱导方法。油酸(ST2053)可以诱导培养细胞内脂滴生成，从而可以作为阳性对照。诱导培养细胞内形成脂滴的具体方法如下。
a.37ºC条件下加热油酸，使其完全成为液体。
b.取63μl的油酸，加入到937μl的DMSO中，充分混匀，配制成200mM的油酸贮存液。贮存液可以保存在4ºC，使用时37ºC条件下加热混匀后即可使用。
c.细胞诱导前，配制含油酸的完全培养液。使用细胞的完全培养液按500:1稀释油酸贮存液，使油酸终浓度为400μM。
注：油酸具有一定的细胞毒性，因细胞而异，可以根据不同细胞状况调整油酸的使用终浓度。
d.待检测的细胞加入含油酸的完全培养液，37ºC培养过夜。一般情况下，次日可以观察到囊泡状的脂滴。
参考文献：
1.Olzmann JA, Carvalho P. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019. 20(3):137-155.
2.Thiam AR, Farese RV Jr, Walther TC. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013. 14(12):775-86.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
C0157	油红O染色试剂盒	50-250次/200-1000次
C0158	改良油红O染色试剂盒	50-250次/200-1000次
C2050	脂滴红色荧光检测试剂盒(LD540)	100-1000次/500-5000次
C2051	脂滴红色荧光检测试剂盒(Nile Red)	100-1000次/500-5000次
C2052	脂滴蓝色荧光检测试剂盒(LipiD-Blue)	100-1000次/500-5000次
C2053	脂滴绿色荧光检测试剂盒(BODIPY 493/503)	100-1000次/500-5000次
C2054	脂滴绿色荧光检测试剂盒(LipiD-Green)	100-1000次/500-5000次
C2055	BODIPY 500/510 C1, C12 (脂肪酸绿色荧光探针)	1mg/5mg/25mg
S0576	脂肪酸摄取荧光检测试剂盒(绿色荧光标记月桂酸)	100-1000次/500-5000次
ST2053	油酸(≥99%, Cell Culture Grade)	100μl/500μl/2ml