碧云天的脂滴红色荧光检测试剂盒(LD540)，英文名为Lipid Droplet Red Fluorescence Assay Kit with LD540，也称LD540 Staining Kit或Red Neutral Lipid Stain，是一种基于新型高灵敏高精度荧光探针LD540来检测细胞内脂滴(Lipid droplets)的试剂盒。本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统。

脂滴是由磷脂单分子层及甘油三酯(Triglyceride)、胆固醇酯(Cholesteryl ester, CE)组成的中性脂肪(Neutral lipid)疏水核心构成，广泛存在于动物、细菌、酵母、植物和昆虫细胞中[1]。脂滴能够沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器相互作用，在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解、以及信号传导过程中起着重要的作用。多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病和Niemann Pick C疾病等，可能都伴随着脂质贮存的异常[2]。

本试剂盒所使用的荧光探针为LD540 (4,4-Di-fluoro-2,3;5,6-bis-(tetra-methylene)-4-bora-3a,4a-di-aza-s-indacene)，LD540是一种基于BODIPY荧光基团修饰的新型高灵敏度亲脂性染料，可与绿色荧光的BODIPY 493/503实现良好的脂滴共定位(图2)，适用于脂滴的精确标记和成像。LD540具有良好的光稳定性和适宜的荧光光谱，可与多种常用荧光染料(如GFP、DAPI和Alexa Fluor 647等)兼容，支持多色成像的需求。此外，LD540同时适用于固定的细胞和活细胞，并能标记超小脂滴[3-5]。

LD540的分子式为C18H21BF2N2，分子量为314.18，CAS号为151486-58-7，其在乙醇中最大激发光波长约为537nm，最大发射光波长约为544nm。LD540的化学结构式和在乙醇中的激发光和发射光光谱参考图1。

图1. LD540的化学结构和在无水乙醇中的激发光和发射光光谱。

LD540在水和其它极性溶剂中几乎无任何荧光，一旦与甘油三酯等中性脂肪结合，便发出明亮的红色荧光。使用本试剂盒检测细胞内脂滴的效果请参考图2。

图2. 碧云天脂滴红色荧光检测试剂盒(LD540) (C2050)检测HeLa细胞内脂滴的效果图。图A为正常HeLa细胞在显微镜明场下的形态，正常细胞内无明显的脂滴聚集现象，因此经BODIPY 493/503 (图B)和LD540 (图C)染色后呈较弱的荧光，主要是细胞膜上脂类的微弱染色；图F为使用400µM油酸(Oleic acid) (ST2053)诱导24小时后细胞在显微镜明场下形态，此时细胞内有很明显的脂滴聚集，脂滴经过BODIPY 493/503 (图G) 和LD540 (图H)染色后，呈现非常明亮的荧光，且两者表现出良好的共定位(图J)。图D和图I呈现了细胞核的染色效果，图E、J为BODIPY 493/503、LD540和Hoechst 33342荧光染色的叠加图。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

本试剂盒染色细胞后用于流式检测的效果请参考图3。

图3. 碧云天脂滴红色荧光检测试剂盒(LD540) (C2050)用于流式细胞仪检测的效果图。HeLa细胞经400µM油酸诱导24小时后，使用本试剂盒染色并进行流式检测。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

对于96孔板中的样品，按照每孔使用100μl染色液计算，本试剂盒小包装和中包装分别可以进行1000次和5000次检测；如果用于流式细胞仪检测，按照每个样品的检测体系体积为0.5ml时，本试剂盒小包装和中包装分别可以进行200次和1000次检测；对于6孔板中的贴壁培养细胞样品，按照每孔使用1ml染色液计算，本试剂盒小包装和中包装分别可以进行100次和500次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C2050S-1	LD540 (1000X)	0.1ml
C2050S-2	Hoechst 33342 (1000X)	0.1ml
C2050S-3	Assay Buffer	100ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
C2050M-1	LD540 (1000X)	0.5ml
C2050M-2	Hoechst 33342 (1000X)	0.5ml
C2050M-3	Assay Buffer	500ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，至少一年有效。LD540 (1000X)和Hoechst 33342 (1000X)须避光保存。

注意事项：

第一次使用时LD540 (1000X)建议适当分装，避免反复冻融。

LD540的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等可根据所使用的细胞进行适当摸索和优化，例如LD540的浓度对于活细胞染色可在0.5X-2X之间适当调整，对于固定细胞染色可在0.1X-0.5X之间适当调整。

LD540在激光照射下很容易发生淬灭，因此需要在保证荧光亮度的前提下尽可能降低染料使用浓度，降低荧光显微镜激发光强度，缩短拍照时间。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 染色液的配制。
按照6孔板每孔1ml脂滴染色液的体系，参考下表配制适量的染色液，并充分混匀。

Reagent	1 Sample	10 Samples	100 Samples
LD540 (1000X)	1μl	10μl	100μl
Hoechst 33342 (1000X)	1μl	10μl	100μl
Assay Buffer	998μl	9.98ml	99.8ml
Staining Solution	1ml	10ml	100ml

注：配制好的Staining Solution必须一次使用完毕，不建议冻存或4ºC保存后继续使用。染色液中LD540的浓度对于活细胞染色可以根据染色效果在0.5X-2X之间适当调整，对于固定细胞染色可以根据染色效果在0.1X-0.5X之间适当调整。
2. 荧光显微镜检测。
a. 接种培养。将细胞接种于6孔板等多孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上。如有必要，按实验设计对细胞进行一定处理。
b. 固定(选做)。
(a) 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤两遍，吸除PBS。
(b) 加入4%多聚甲醛固定液(P0099)室温固定10-15分钟。
注1：LD540和Hoechst 33342都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色[3]。
注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解细胞膜的去垢剂如含Saponin (P0095)或Digitonin (ST1272)的通透液，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。
c. 染色。
(a) 取出待检测的细胞，PBS洗涤1-2遍。
(b) 吸除PBS，加入适当体积的Staining Solution，通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。室温下避光孵育10-20分钟。
(c) PBS洗涤两遍。
d. 检测。使用荧光显微镜观察时选择使用537nm左右激发，观察红色荧光。
注：使用荧光显微镜拍照时，为了减少荧光淬灭，尽可能降低荧光显微镜的激发光强度，缩短拍照时间。
3. 流式细胞仪检测。
a. 细胞准备。
(a) 贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤一次；悬浮细胞250-1000×g室温离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤一次。每个样品推荐的细胞用量为10⁶个细胞。
(b) 400×g室温离心5分钟，弃上清。
b. 固定(选做)。
(a) 加入4%多聚甲醛固定液(P0099)，轻轻吹打重悬为单细胞悬液，室温固定10-15分钟。
(b) 固定结束后，400×g室温离心5分钟，弃上清。
(c) 加入0.5ml PBS后缓慢用移液器吹打洗涤，然后400×g室温离心5分钟，弃上清。
注1：LD540和Hoechst 33342都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色[3]。
注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解细胞膜的去垢剂如含Saponin (P0095)或Digitonin (ST1272)的通透液，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。
c. 染色。
(a) 对于上一步骤的细胞沉淀，除背景对照管外，其余每管加入0.5ml Staining Solution，轻柔并充分重悬细胞，室温避光孵育10-15分钟。
(b) 400×g室温离心5分钟，弃上清。
(c) 每孔加入0.5ml PBS后缓慢用移液器吹打洗涤，然后400×g室温离心5分钟，弃上清。
(d) 每孔加入0.5ml PBS重悬细胞。
d. 检测。检测时参考其光谱特征选择合适的检测条件，例如Ex/Em=537/544nm。
注1：使用仅含Assay Buffer并且未经染色的细胞样品用于流式细胞仪的阴性对照设置。
注2：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对LD540的稀释倍数进行适当调整。
4. 荧光酶标仪检测。
a. 接种培养。将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，如BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖，独立包装) (FCP966)，每孔的细胞数需要控制在100-10,000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理。
b. 固定(选做)。
(a) 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤两遍，吸除PBS。
(b) 加入4%多聚甲醛固定液(P0099)室温固定10-15分钟。
注1：LD540和Hoechst 33342都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色[3]。
注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解细胞膜的去垢剂如含Saponin (P0095)或Digitonin (ST1272)的通透液，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。
c. 染色。
(a) 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤1-2遍。
(b) 吸除PBS，加入适当体积的Staining Solution，通常96孔板每孔加入100μl。室温下避光孵育10-20分钟。
(c) PBS洗涤两遍。
d. 检测。参考其光谱特征，选取合适的波长进行读板，例如Ex/Em=537/544nm。具体根据酶标仪的特点选择，也不一定需要选用最大激发光/发射光波长来检测。
5. 阳性对照的诱导方法。油酸(ST2053)可以诱导培养细胞内脂滴生成，从而可以作为阳性对照。诱导培养细胞内形成脂滴的具体方法如下。
a. 37ºC条件下加热油酸，使其完全成为液体。
b. 取63μl的油酸，加入到937μl的DMSO中，充分混匀，配制成200mM的油酸贮存液。贮存液可以保存在4ºC，使用时37ºC条件下加热混匀后即可使用。
c. 细胞诱导前，配制含油酸的完全培养液。使用细胞的完全培养液按500:1稀释油酸贮存液，使油酸终浓度为400μM。
注：油酸具有一定的细胞毒性，因细胞而异，可以根据不同细胞状况调整油酸的使用终浓度。
d. 待检测的细胞加入含油酸的完全培养液，37ºC培养过夜。一般情况下，次日可以观察到囊泡状的脂滴。
参考文献：
1. Olzmann JA, Carvalho P. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019. 20(3):137-155.
2. Thiam AR, Farese RV Jr, Walther TC. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013. 14(12):775-86.
3. Spandl J, White DJ, Peychl J, Thiele C. Traffic. 2009.10(11):1579-84.
4. Salo VT, Li S, Vihinen H, Hölttä-Vuori M, Szkalisity A, et al. Dev Cell. 2019. 50(4):478-493.
5. Pfisterer SG, Gateva G, Horvath P, Pirhonen J, Salo VT, et al. Nat Commun. 2017. 8:14858.
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