碧云天研发生产的Flag标签蛋白超快速Western检测试剂盒(Superquick Western Assay Kit for Flag Tag)，是一种仅需10分钟就可以从完成转印的印迹膜到获得带Flag标签的融合蛋白条带的超快速Western检测试剂盒。本试剂盒包含了Anti-Flag Tag-HRP、QuickBlock™封闭和抗体稀释液、Western洗涤液、以及BeyoECL Star化学发光试剂的试剂盒，一抗和二抗孵育合并为一步操作，使用便捷，背景低，包含从封闭到化学发光的整套试剂，转膜完成后通常10分钟就可以得到高质量的标签蛋白Western结果，可以极大加快标签蛋白的检测速度。

Flag标签、HA标签、Myc标签、His标签、GST标签等是表达载体上最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地用于目的蛋白的表达、纯化或检测，无需目的蛋白特异的抗体[1-2]。本系列产品目前包括Flag标签蛋白/HA标签蛋白/Myc标签蛋白/His标签蛋白/His标签蛋白(C-terminal)/GFP标签蛋白/GST标签蛋白/V5标签蛋白/MBP标签蛋白/StrepII标签蛋白/AVI标签蛋白超快速Western检测试剂盒(P0981/P0982/P0983/P0984/P0985/P0986/P0987/P0988/P0990/P0992/P0997)。

本试剂盒中的QuickBlock™封闭和抗体稀释液，可同时用于印迹膜的封闭和抗体的稀释。封闭时间仅需1分钟，总体效果显著优于传统的基于BSA(牛血清白蛋白)、脱脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封闭液。本产品稀释和配制的标签抗体工作液，可以在4ºC保存和使用不少于1个月，并且可以重复使用。

本试剂盒使用了Anti-Flag Tag-HRP，因此一抗和二抗的孵育仅需一步即可完成。抗体特异性高、灵敏度极佳，使用浓度经过优化，按照1:500比例稀释，室温通常孵育5分钟即可进行后续的洗涤和检测。

本试剂盒中提供的BeyoECL Star化学发光试剂，灵敏度高、背景极低、发光时间长，适用于大多数常规的Western检测。特殊情况下，如果成像效果需要优化，可根据当前实验结果选择灵敏度更高的BeyoECL Moon (P0018F)或BeyoECL SuperMoon (P0018H)。

使用本试剂盒从完成转印的印迹膜开始实际操作约10分钟，检测获得的Flag Tag条带的效果，请参见图1。

图1.碧云天Flag标签蛋白超快速Western检测试剂盒(P0981)的检测效果图。每组实验从左到右为1µg、2µg、5µg、10µg总蛋白量的含Flag标签融合蛋白HEK293细胞裂解液，Western印迹成像由BeyoImager™ 600化学发光成像系统(EI600)完成。根据灰度分析，各蛋白裂解液样品的Flag Tag条带灰度与上样量成相应的比例关系。实际实验结果会因样品、抗体、实验条件等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

如果检测的是6.6×8.5cm印迹膜，按照每次Western封闭需要QuickBlock™封闭和抗体稀释液5ml，稀释抗体需要QuickBlock™封闭和抗体稀释液5ml，抗体10μl，稀释后的抗体共计可以使用3次，洗涤液每次使用10ml，化学发光试剂工作液每次需要1ml计算，本试剂盒小包装和中包装分别可以进行6次和30次Flag Tag的Western快速检测。如果检测的是更常见的裁切后的约2×8.5cm印迹膜，按照封闭以及抗体孵育液体用量为每次2ml，洗涤液用量每次4ml，发光试剂工作液用量每次0.4ml计算，小包装和中包装分别可以检测15次和75次。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
P0981S-1	Anti-Flag Tag-HRP	20μl
P0981S-2	QuickBlock™封闭和抗体稀释液	40ml
P0981S-3	Western洗涤液	200ml
P0981S-4	BeyoECL Star A液	3ml
P0981S-5	BeyoECL Star B液	3ml
-	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P0981M-1	Anti-Flag Tag-HRP	100μl
P0981M-2	QuickBlock™封闭和抗体稀释液	200ml
P0981M-3	Western洗涤液	2×500ml
P0981M-4	BeyoECL Star A液	15ml
P0981M-5	BeyoECL Star B液	15ml
-	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。QuickBlock™封闭和抗体稀释液、Western洗涤液以及BeyoECL Star A液和B液，4ºC保存，至少6个月有效。

注意事项：

请注意回收使用过的抗体工作液。回收的抗体工作液可以再重复使用2次。稀释后的抗体，包括使用过的抗体工作液，请4ºC保存。

回收后重复使用的抗体工作液，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10,000×g离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体工作液出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。

使用本产品，通常10分钟可得到高质量的标签蛋白Western结果，即封闭1分钟、抗体孵育5分钟、洗涤30秒3次、BeyoECL试剂孵育1分钟、成像通常0.5分钟之内。

对于6.6×8.5cm的印迹膜，推荐使用碧云天的Western洗膜盒(FFX050)进行洗涤和孵育；对于裁切后的条形印迹膜，推荐使用碧云天的5格Western洗膜盒(FFX055)进行洗涤和孵育。

个别情况，如果希望获得到更好的Western结果，可适当增加封闭、抗体孵育及洗涤的时间，并适当优化成像的曝光时间。

BeyoECL Star A液和B液均对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
以6.6×8.5cm的印迹膜为例：
1.膜的封闭。
a.完成转膜后，立即把印迹膜(约6.6×8.5cm)放置到预先加入5ml QuickBlock™封闭和抗体稀释液的Western洗膜盒(FFX050)中，置于翘板摇床上缓慢摇动，室温封闭1分钟。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。后续如果无特殊说明，各种试剂的用量都以约6.6×8.5cm大小的印迹膜为例进行说明。
注1：经反复测试，室温封闭1分钟即可达到理想的封闭效果，但也可以根据实际情况酌情延长封闭时间。如果需要更多的封闭液，推荐碧云天的QuickBlock™ Western封闭液(P0252)。
注2：如果使用裁切后的约2×8.5cm印迹膜，推荐使用2ml QuickBlock™封闭和抗体稀释液。
2.抗体孵育。
a.Anti-Flag Tag-HRP抗体工作液的配制。推荐抗体稀释比例为1:500，例如在5ml QuickBlock™封闭和抗体稀释液中加入10μl Anti-Flag Tag-HRP，即可得到5ml Anti-Flag Tag-HRP抗体工作液。
注：通常1:500稀释可以适用于大多数情况，但如果遇到样品中目的蛋白过少或过多时，也可以根据实际情况在1:250～1:1000范围内进行调整。如果需要更多的抗体稀释液，推荐碧云天的QuickBlock™ Western一抗稀释液(P0256)。
b.用微型台式真空泵、移液器或滴管等吸尽用于封闭的QuickBlock™封闭和抗体稀释液。推荐使用BeyoVac™基础型台式真空吸液器(E6878)或BeyoVac™调速型台式真空吸液器(E6883)。
c.加入5ml Anti-Flag Tag-HRP抗体工作液。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，推荐用量为2ml。
d.置于翘板摇床上缓慢摇动，室温孵育5分钟。
注：经反复测试，室温孵育5分钟即可达到理想检测效果，但也可以根据实际情况酌情延长抗体孵育时间。
e.回收抗体工作液，留待后续重复使用。
f.使用Western洗涤液洗涤3次，每次的用量为10ml，每次30秒。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，每次的推荐用量为4ml。
注：经反复测试，洗涤3次，每次30秒，即可达到理想效果，但也可以根据实际情况每次酌情延长洗涤时间或增加洗涤次数。如果需要更多的Western洗涤液，推荐碧云天的Western洗涤液(P0023C)或Western洗涤液(10X) (P0023C3/P0023C6)。
3.蛋白检测。
a.BeyoECL Star工作液的配制：混合0.5ml BeyoECL Star A液和0.5ml BeyoECL Star B液，配制成1ml BeyoECL Star工作液，室温放置备用。工作液宜在临检测前配制。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BeyoECL Star工作液配制0.4ml即可。
b.用WB专用镊子(FS035)将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。
c.滴加1ml BeyoECL Star工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1分钟。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BeyoECL Star工作液的推荐用量为0.4ml。
注：通常放置1分钟就可以进行后续的成像或压片检测，但也可以根据实际情况酌情延长放置时间。如果需要更多的BeyoECL Star，推荐碧云天的BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒) (P0018A)。
d.取膜，弃BeyoECL Star工作液，用吸水纸略吸去过多的液体。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行化学发光成像仪检测或压片检测。
注：详细的Western实验步骤可以参考碧云天的相关网页：http://www.beyotime.com/support/western.htm。
参考文献：
1.Terpe, K. Appl Microbiol Biotechnol. 2003. 60, 523–533.
2.Cho S Y, Park S G, Lee D H, et al. BMB Reports. 2004. 37(1): 45-52.
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