碧云天生产的Flag标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法) (Flag-tag Protein IP Assay Kit with Magnetic Beads)是一种通过高特异性的Anti-Flag磁珠进行Flag标签融合蛋白免疫沉淀或免疫共沉淀的试剂盒。本产品的免疫沉淀产物，可以用于Flag标签融合蛋白或其蛋白复合物组分的检测。
本试剂盒包含高质量的Anti-Flag磁珠及经过优化验证的免疫沉淀必要试剂，使免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP，也称Pull-down)或免疫共沉淀(Co-IP)实验更加简单、便捷、高效，广泛用于带有Flag标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀、免疫共沉淀或纯化等实验。
免疫沉淀或免疫共沉淀是研究蛋白或蛋白与蛋白相互作用(Protein-Protein Interactions, PPIs)的常用实验技术，通过使用特异性抗体和可结合抗体的介质(如Protein A/G Agarose或Protein A/G磁珠)，或直接使用偶联特异性抗体的介质(如琼脂糖凝胶或磁珠)，然后通过离心或磁力从溶液中分离出抗原和抗体复合物，从而将目标蛋白质从复杂样品中分离出来，随后可以用于Western印迹检测或质谱分析等[1-2]。
Flag标签(Flag-tag)、Myc标签(Myc-tag)、HA标签(HA-tag)、V5标签(V5-tag)、His标签(His-tag)和GST标签(GST-tag)等是表达载体上最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地检测目的蛋白及与目的蛋白相互结合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的纯化。
Flag-tag是8个氨基酸残基(DYKDDDDK)组成的多肽，常用的形式有Flag和3X Flag，通过基因重组技术把Flag-tag的核酸序列与目的基因的5'端或3'端连接，就可以最终表达形成Flag-tag的目的蛋白。Flag-tag具有以下优点：Flag-tag通常不会与目的蛋白相互作用，并且大多数情况下不会影响目的蛋白的功能；Flag-tag作为标签蛋白，后续通过Flag抗体(AF519/AF2852)、Anti-Flag磁珠(P2115)或Anti-Flag亲和凝胶(P2271/P2282)可对目的基因的表达、定位及功能进行检测或对目的蛋白进行纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等；融合在N端的Flag标签，可被肠激酶(Enterokinase, EK)切除(DDDK)，从而得到完美的没有标签的目的蛋白。基于以上优点，Flag标签已被广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、相互作用和功能等多方面的研究[3]。
本试剂盒包含高质量的BeyoMag™ Anti-Flag Magnetic Beads (Anti-Flag磁珠)、BeyoMag™ Mouse IgG Magnetic Beads (小鼠IgG磁珠，作为阴性对照)及优化的各种缓冲液如Lysis Buffer、TBS (10X)、Protease Inhibitor Cocktail (100X)、3X Flag Peptide (25X)、Acid Elution Buffer、Neutralization Buffer、SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)等免疫沉淀必要试剂，使免疫沉淀或免疫共沉淀实验更加简单、便捷、高效。本试剂盒进行免疫沉淀的流程参考图1。
图1.碧云天Flag标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)的免疫沉淀流程图。
本试剂盒中的BeyoMag™ Anti-Flag Magnetic Beads (Anti-Flag磁珠)，也被称为Anti-DYKDDDDK Magnetic Beads，可以特异性地结合Flag标签融合蛋白，并可以借助磁力架等磁分离设备非常便捷地应用于带有Flag标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀或纯化等实验。其特点有：(1)特异性强、靶蛋白结合量高。与国内外大多数的同类产品相比，本Anti-Flag磁珠抗体结合密度高，对带有Flag标签蛋白的结合具有很强的特异性，并且磁珠粒径小，不易产生非特异吸附。每毫升磁珠悬浊液含约10mg磁珠，含有不少于0.6mg Flag抗体，通常可结合不少于0.6mg Flag标签融合蛋白，具体的最大结合量和标签蛋白的分子量大小等相关。每500μl样品，通常仅需使用10-20μl磁珠悬浊液，就可以高效地进行免疫沉淀实验。(2)可结合多种形式的Flag标签蛋白。Anti-Flag磁珠可特异性地结合甲硫氨酸修饰的N端Flag融合蛋白(Met-Flag-Protein)、N端Flag融合蛋白(Flag-Protein)、C端Flag融合蛋白(Protein-Flag)。(3)结合目的蛋白速度快。Anti-Flag磁珠为纳米级磁珠(~200nm)，具有超大的比表面积，便于抗体和抗原的快速有效结合。通常10分钟内即可完成抗原吸附的过程，30分钟内完成目的蛋白免疫沉淀操作。缩短操作时间可以有效避免在长时间操作过程中目的蛋白的降解或变性，充分保证目的蛋白的活性。本试剂盒中Anti-Flag磁珠的主要指标如下表：
| Characteristics | Description |
| Product content | 10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer |
| Beads size | ~200nm |
| Magnetization | Superparamagnetic |
| Coupled antibody | Anti-Flag mouse monoclonal antibody |
| Isotype | IgG2b |
| M.W. of antibody | Approximately 150kDa |
| Antibody concentration | ≥0.6mg Flag antibody per ml beads |
| Binding capacity | ≥0.6mg Flag‐tagged fusion protein per ml beads |
| Specificity | Met-Flag-Protein, Flag-Protein, Protein-Flag |
| Elution method | Acid, peptide competitive or SDS‐PAGE loading buffer elution. Note: If elute with SDS-PAGE loading buffer, the light (~25kDa) and heavy (~50kDa) chain of Flag antibody will be denatured and release from the beads. |
| Application | IP, Co-IP, Protein purification |
本试剂盒提供三种洗脱方法。根据目的蛋白的结构、生物学功能及后续应用的要求等，本试剂盒提供三种洗脱方法，包括Flag多肽、酸性和SDS-PAGE上样缓冲液洗脱液进行洗脱。特别是Flag多肽洗脱后不会包含抗体的轻链和重链，可以有效解决免疫沉淀后Western实验中轻链和重链的干扰问题。本试剂盒用于GFP-Flag融合蛋白的免疫沉淀效果参考图2，本试剂盒用于p53和LTA (SV40 Large T antigen)的免疫共沉淀效果参考图3 [4]。
图2.碧云天Flag标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)用于GFP-Flag融合蛋白的免疫沉淀效果图。293T细胞(人胚肾细胞)转染GFP-Flag质粒36小时后，经Lysis Buffer裂解。样品1为Input，即全细胞裂解液(total cell lysate)；样品2为BeyoMag™ Mouse IgG Magnetic Beads (小鼠IgG磁珠)免疫沉淀后经SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)洗脱后的样品，该Mouse IgG是正常的小鼠IgG (Normal Mouse IgG)，为阴性对照；样品3和4都为本试剂盒中BeyoMag™ Anti-Flag Magnetic Beads (Anti-Flag磁珠)免疫沉淀后的样品，其中样品3使用SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)洗脱，样品4使用本试剂盒提供的3X Flag Peptide洗脱。使用SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)洗脱后可以检测到Flag抗体的轻重链，而使用3X Flag Peptide洗脱仅含有GFP-Flag，整个泳道仅检测到单一的目的条带。Western印迹成像由BeyoImager™ 600化学发光成像系统完成(EI600)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
图3. 碧云天Flag标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)用于Flag-p53和Myc-LTA融合蛋白的免疫共沉淀效果图。293T细胞(人胚肾细胞)单独或共转染pCMV-3X Flag-p53 (D3031)、pCMV-Myc-LTA (D3036)质粒36小时后，使用本试剂盒中的Lysis Buffer裂解。泳道1为Mouse IgG Magnetic Beads (小鼠IgG免疫磁珠)免疫沉淀后经本试剂盒提供的3X Flag Peptide洗脱后的样品，该Mouse IgG是正常的小鼠IgG (Normal Mouse IgG)，为免疫共沉淀的阴性对照；泳道2、3和4为BeyoMag™ Anti-Flag Magnetic Beads免疫沉淀后，经本试剂盒提供的3X Flag Peptide洗脱后的样品，从泳道4可观察到共转染的Flag-p53与Myc-LTA可以相互作用。Input即全细胞裂解液(Total cell lysate)。Western印迹成像由BeyoImager™ 600化学发光成像系统完成(EI600)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
对于常规的免疫沉淀实验，按照每500μl样品使用20μl磁珠悬浊液，本试剂盒小包装P2181S和中包装P2181M分别可以进行20次和100次样品的免疫沉淀，同时分别可以进行4个和20个阴性对照的免疫沉淀；按照每100μl样品使用4μl磁珠悬浊液，则分别可以进行100次和500次样品的免疫沉淀，同时分别可以进行20个和100个阴性对照的免疫沉淀。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2181S-1 | Lysis Buffer | 50ml |
| P2181S-2 | TBS (10X) | 5ml |
| P2181S-3 | Protease Inhibitor Cocktail (100X) | 0.5ml |
| P2181S-4 | BeyoMag™ Anti-Flag Magnetic Beads | 0.4ml |
| P2181S-5 | BeyoMag™ Mouse IgG Magnetic Beads | 80μl |
| P2181S-6 | 3X Flag Peptide (25X) | 80μl |
| P2181S-7 | Acid Elution Buffer | 2ml |
| P2181S-8 | Neutralization Buffer | 0.2ml |
| P2181S-9 | SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X) | 0.4ml |
| － | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2181M-1 | Lysis Buffer | 250ml |
| P2181M-2 | TBS (10X) | 15ml |
| P2181M-3 | Protease Inhibitor Cocktail (100X) | 2.5ml |
| P2181M-4 | BeyoMag™ Anti-Flag Magnetic Beads | 2ml |
| P2181M-5 | BeyoMag™ Mouse IgG Magnetic Beads | 0.4ml |
| P2181M-6 | 3X Flag Peptide (25X) | 0.4ml |
| P2181M-7 | Acid Elution Buffer | 10ml |
| P2181M-8 | Neutralization Buffer | 1ml |
| P2181M-9 | SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X) | 2ml |
| － | 说明书 | 1份 |
-20℃保存，一年有效。P2181-4 BeyoMag™ Anti-Flag Magnetic Beads和P2181-5 BeyoMag™ Mouse IgG Magnetic Beads可以4℃保存。
注意事项：需自备磁分离架，推荐使用碧云天的1.5/2ml磁分离架(FMS004、FMS008、FMS012、FMS016、FMS024)。
如果免疫沉淀的目的蛋白涉及磷酸化修饰或者乙酰化修饰，需要自备相应的磷酸酶抑制剂和去乙酰化酶抑制剂。推荐选购碧云天的磷酸酶抑制剂混合物A (50X) (P1081/P1082)和去乙酰化酶抑制剂混合物(100X) (P1112/P1113)。
本试剂盒提供的Lysis Buffer经反复测试，适合很多情况下的免疫沉淀或免疫共沉淀时的样品裂解和后续的洗涤。但由于免疫沉淀或免疫共沉淀蛋白样品的复杂性和特殊性，本Lysis Buffer不一定适合所有免疫沉淀样品的裂解与洗涤。在使用本试剂盒提供的Lysis Buffer效果欠佳的情况下，需要自行对于裂解液和洗涤液进行摸索和调整。此时建议根据文献自行配制裂解液和洗涤液，或尝试碧云天的其它适当裂解液：http://www.beyotime.com/support/lysis-buffer.htm。
BeyoMag™系列磁珠经测试，反复冻融3次以上，不影响使用效果。
BeyoMag™ Magnetic Beads需维持pH为6-8，避免高速离心、干燥或冻存；请勿长时间将磁珠置于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。
BeyoMag™ Magnetic Beads使用前要适当充分重悬，即颠倒若干次使磁珠混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免抗体变性等。
在免疫沉淀时，建议设置阳性和阴性对照组(BeyoMag™ Mouse IgG Magnetic Beads)。本试剂盒中提供适量的阴性对照，更多需求，可以订购碧云天的BeyoMag™ Mouse IgG Magnetic Beads (小鼠IgG磁珠) (P2171)。
蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。
如果使用真空泵等仪器吸取上清液，须注意真空泵的吸液强度，以免吸力过大而吸取到聚集的磁珠。
酸性溶液洗脱时磁珠可能会发生聚集，属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。0.1%的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集，并且不会影响磁珠的抗体结合效率。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
| Steps | Solution required | Volume per assay | Volume per assay |
| Cell lysis and sample preparation | Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail | 100μl | 500μl |
| Preparation of 3X Flag Peptide elution buffer and magnetic beads | TBS | ~0.52ml | ~1.6ml |
| Immunoprecipitation | Magnetic Beads | 4μl | 20μl |
| Wash (3 times) | Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail | 100μl each time | 500μl each time |
| Peptide competitive elution (optional) | Peptide solution (1X) | 20μl | 100μl |
| Acid elution and neutralization (optional) | Acid Elution Buffer | 20μl | 100μl |
| Neutralization Buffer | 2μl | 10μl | |
| SDS-PAGE sample loading buffer elution (optional) | SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X) | 20μl | 100μl |
| Problem | Possible Causes | Solution |
| Very few or no tagged protein exists in the eluate. | Protein is not completely eluted. | Change elution methods. |
| No target protein expressed. | Make sure the protein of interest contains the tagged protein by Western blot or dot blot analyses. | |
| Very low protein expression level. | 1.Use larger volume of cell lysate. 2.Optimize expression conditions to raise the protein expression level. |
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| Washes are too stringent. | Reduce the time and number of washes. | |
| Incubation times are inadequate. | Increase the incubation time. | |
| Interfering substance is present in sample. | Lysates containing high concentration of DTT, 2-mercaptoethanol, or other reducing agents may destroy antibody function, and must be avoided. | |
| Detection system is inadequate. | If Western blot detection is used: 1.Check primary and secondary antibodies using proper controls to confirm binding and reactivity. 2.Verify that the transfer was adequate by using prestained protein marker or staining the membrane with Ponceau S. 3.Use fresh detection substrate or try a different detection system. |
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| Background is too high. | Proteins bind nonspecifically to the monoclonal antibody, insufficient washing on magnetic beads, or the microcentrifuge tubes. | 1.Pre-clear lysate with Mouse IgG Magnetic Beads (P2171) to remove nonspecific binding proteins. 2. After suspending beads for the final wash, transfer entire sample to a clean microcentrifuge tube before centrifugation. |
| Washes are insufficient. | 1.Increase the number of washes. 2.Prolong duration of the washes, incubating each wash for at least 15 minutes. 3.Choose other wash buffers. Increase the salt and/or detergent concentrations in the wash solutions. 4.Centrifuge at lower speed to avoid nonspecific trapping of denatured proteins. |
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| Multiple protein bands found in the eluate. | The protein is not stable at room temperature. | Purify the target protein at lower temperature, such as 4℃. |
| Protein degradation due to proteases activity during purification process. | Add protease inhibitors to cell lysate. | |
| Non‐specific binding. | 1.Prepare cell lysate again. 2.Add additional wash steps. |
