碧云天生产的蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法)，即Protein Cysteine Assay Kit with DTNB，也称蛋白质半胱氨酸含量检测试剂盒，是一种高效、便捷的用于细胞培养上清液、血清、血浆、细胞及组织裂解液样品中暴露的或表面的游离巯基(Exposed/Surface free sulfhydryl groups)和埋藏于蛋白内部的游离巯基(Buried free sulfhydryl groups)以及蛋白质中的二硫键(-S-S-, Disulfide bonds)被还原后的巯基检测试剂盒。本试剂盒采用显色法(吸光度法)进行检测。

巯基(Sulfhydryl groups or Thiols)，又称氢硫基或硫醇基，化学式为-SH。巯基是生物系统中反应性非常强并且广泛存在的基团之一，它存在于大多数蛋白质中，也存在于一些低分子量物质中，如谷胱甘肽(GSH)、CoA、脂酸、DTT、巯基乙酸盐和游离半胱氨酸等[1]。蛋白质中的巯基通常可分为暴露的游离巯基(Exposed/Surface free sulfhydryl groups)和在蛋白质高级结构中的游离巯基(Buried free sulfhydryl groups)，两者之和为总游离巯基(Total free sulfhydryls or unbound thiols)[2]。通常，蛋白质中的游离巯基指的是暴露的游离巯基，即活性巯基，主要存在于半胱氨酸中，是蛋白质结构和生物体内某些氧化还原反应的重要基团，在蛋白质中两个巯基脱氢而形成的二硫键(-S-S-, Disulfide bonds)，使相邻多肽得以连接。本试剂盒使用变性剂将样品中的蛋白进行变性，暴露二硫键和巯基，然后利用还原剂将所有二硫键进行还原，最后检测样品经变性和还原后的巯基含量，作为半胱氨酸的含量。

生物体内的巯基主要为谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基，其中谷胱甘肽巯基主要参与修复氧化损伤的蛋白质和活性氧的清除[3]；蛋白质巯基则主要通过形成二硫键发挥维持蛋白质构象的作用[4]，而蛋白质中检测到增多的游离巯基则提示二硫键发生断裂，蛋白质结构发生变化。目前，巯基传统的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-GC)等[5]。虽然这些方法在游离巯基检测的灵敏度和准确度上有一定优势，但是样品处理和实验操作相对复杂、对仪器的要求较高、检测耗时较长、且无法同时检测多个样品。

本试剂盒采用经典的基于DTNB的游离巯基定量检测方法。5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB)，又称为6,6′-二硝基-3,3′-二硫代苯甲酸、Ellman试剂(Ellman Reagent)、二硫代硝基苯甲酸或双(3-羧基-4-硝基苯基)二硫，是一种与巯基相互作用的水溶性试剂，可用于组织、蛋白质和多肽中巯基含量测定，基本反应原理如下：样品中的蛋白质通过变性处理，原有构像发生改变，蛋白质肽链松散开，二硫键或者巯基暴露，还原剂将二硫键还原成巯基(-SH)，巯基(R-SH)与DTNB反应生成黄色可检测的2-硝基-5-硫代苯甲酸盐阴离子(TNB)和混合二硫化物(R-S-TNB)，TNB在412nm处有强吸收峰，测定此处的吸光度，并以谷胱甘肽为标准品，可计算出样品中半胱氨酸的含量[6]。本试剂盒不仅可检测暴露的或表面的游离巯基，还可以检测蛋白质高级结构中的游离巯基，以及蛋白质中二硫键还原后产生的游离巯基。如需检测总游离巯基，可使用总巯基检测试剂盒(DTNB法) (S0141)；如需检测蛋白质中二硫键的含量，可以使用蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法) (S0145)，同时设置未进行步骤3b中设置未添加Reduction Buffer的样品组，通过相应的差值就能计算出蛋白质中的二硫键含量；如需检测游离巯基，可使用游离巯基检测试剂盒(DTNB法) (S0138)，配合总巯基检测试剂盒(DTNB法) (S0141)即可计算出蛋白质高级结构中的游离巯基含量；如需检测谷胱甘肽，可使用总谷胱甘肽检测试剂盒(S0052)、GSH和GSSG检测试剂盒(S0053)。碧云天三种巯基检测试剂盒的比较可以参考碧云天的相关网页：http://www.beyotime.com/support/thiol-assay.htm。

图1.碧云天蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法) (S0145)工作原理图。

本试剂盒样品处理简单，检测速度快。对于细胞培养上清液、血清、血浆可直接检测；对于细胞及组织样品只需匀浆裂解，取上清进行检测。整个检测过程不足4个小时即可完成。

本试剂盒的Assay Buffer经过优化，可螯合可以氧化巯基的二价金属离子，防止样品被氧化导致样品中巯基含量低于实际值。

本试剂盒提供了检测所需的DTNB和Assay Buffer，同时还提供GSH作为标准品或阳性对照(Positive control)。本试剂盒检测GSH标准曲线的效果如图2所示。最低检测限约为10μM。

图2.碧云天蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法) (S0145)用于GSH标准曲线的检测效果图。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

用于96孔板检测时，本试剂盒小包装的可以进行100-200次检测，中包装可以进行500-1000次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0145S-1	Assay Buffer	50ml
S0145S-2	Denaturing Buffer	20ml
S0145S-3	Reduction Buffer	200μl
S0145S-4	Protein Precipitation Solution	200ml
S0145S-5	GSH	4mg
S0145S-6	DTNB	2mg
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
S0145M-1	Assay Buffer	250ml
S0145M-2	Denaturing Buffer	100ml
S0145M-3	Reduction Buffer	1ml
S0145M-4	Protein Precipitation Solution	500ml×2
S0145M-5	GSH	20mg
S0145M-6	DTNB	10mg
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，两年有效。4ºC保存，3个月有效。GSH和DTNB在配制成溶液后，需适当分装，-20ºC保存至少3个月有效。Protein Precipitation Solution须避光保存。

注意事项：

本试剂盒检测时涉及氧化还原反应，因此所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。如果在样品中的还原剂例如DTT、巯基乙醇等，无法避免，则应尽量控制还原剂的总浓度低于待测样品中的巯基浓度。常用的Triton X-100、Tween-20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物，如果必须使用去垢剂，最好使用纯度较高并注明含较低过氧化物的去垢剂。

Reduction Buffer对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。建议在通风橱内操作。Protein Precipitation Solution有腐蚀性，操作时请小心，并确保有效防护以避免直接接触人体，并须注意避免腐蚀其它物品。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备。
a.细胞样品准备：对于悬浮细胞，可以离心收集细胞，并用PBS、HBSS或生理盐水洗涤一遍。后续可以用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)参考相应的说明裂解并制备细胞样品。按照每100万细胞直接加入100-200微升裂解液的比例进行裂解。对于贴壁细胞，也推荐使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)进行裂解，同时可以使用细胞铲或细胞刮(FLFT021/FSCP023/FSCP029)辅助收集细胞样品。如果没有使用推荐的裂解液，出现裂解效果不佳的情况，可以把处在裂解液中的细胞样品用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。随后4℃，12,000×g离心10分钟。取上清用于蛋白质半胱氨酸的测定。
b.细胞培养液上清的准备：对于贴壁细胞，直接吸取培养液上清用于后续的测定；对于悬浮细胞，离心后吸取培养液上清用于后续的测定。
c.组织样品的准备：动物组织可以酌情使用含有0.16mg/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml heparin)灌流清除组织上残留的血液。每20mg组织加入200μl Western及IP细胞裂解液(P0013)或其它的裂解液，用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下匀浆。将匀浆液在4ºC，12,000×g离心10分钟，取上清用于后续的测定。
d.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。
e.上述样品可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。此时测得的蛋白浓度作为CProtein-1用于步骤3f表格中的计算。
2.试剂盒准备工作。
a.GSH Standard (8mM)的配制：在本试剂盒提供的4mg GSH中加入1.627ml Assay Buffer，溶解并混匀，即为8mM的GSH Standard。除立即待用部分外，其余GSH Standard适当分装后于-20ºC保存。
b.DTNB储存液的配制：在本试剂盒提供的每2mg DTNB中加入0.5ml Assay Buffer，溶解并混匀，即为DTNB储存液。除立即待用部分外，其余DTNB储存液适当分装后于-20ºC保存。
c.Ellman's Reagent Solution的配制：每个样品需180μl Ellman's Reagent Solution，请根据样品数量计算所需Ellman's Reagent Solution的总量。将DTNB储存液与Assay Buffer按照1:35的比例混匀，即得Ellman's Reagent Solution。例如取40μl DTNB储存液加入1.4ml Assay Buffer，混匀即得约1.4ml Ellman's Reagent Solution。注：Ellman's Reagent Solution需根据用量配制，现用现配。
3.样品测定。
a.标准曲线的设置：将8mM的GSH Standard用Assay Buffer倍比稀释为0、0.125、0.25、0.5、1、2、4mM。GSH标准曲线请参考图2。也可自行设置适宜的GSH浓度进行标准曲线的设定。
b.样品处理：
(a)蛋白还原：每20μl样品中加入100μl Denaturing Buffer，混匀后再加入2μl Reduction Buffer，混匀后25℃孵育1小时。
注：可根据待测样品的重复测试数量及蛋白浓度的测定需求，确定起始样品总体积。此处以一个样品20μl为例。如需测定蛋白质中二硫键的含量，本步骤需要增加未添加2μl Reduction Buffer的样品组，此时二硫键不会被还原，和添加了Reduction Buffer的样品组相比，其中的差值就是由于二硫键导致的。
(b)蛋白沉淀：孵育结束后，在管中加入1ml Protein Precipitation Solution，混匀后25℃孵育1小时。
(c)离心：孵育结束后，4℃ 5000×g离心15分钟，弃上清。注意不要吸取到沉淀。
(d)蛋白洗涤和重复沉淀：向沉淀中加入500μl Protein Precipitation Solution，用移液器适当吹打均匀，4℃ 5000×g离心15分钟，弃上清。重复本步骤一次。注意不要吸取到沉淀。
(e)蛋白重悬：将沉淀用30μl Assay Buffer重悬，即得到待测样品。
(f)蛋白浓度的再次测定：由于样品在沉淀处理过程中会造成蛋白损失，须取约5-10μl处理后的待测样品用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度；此时测得的蛋白浓度作为CProtein-2用于步骤3f表格中的计算。
c.每孔加入180μl Ellman's Reagent Solution，参考下表分别将20l的标准品或者待测样品加入到96孔板各孔中。空白对照(Blank Control)可以用Assay Buffer代替样品，也可以不设置而使用标准曲线中浓度为0的吸光度值。室温(约20-25ºC)孵育15分钟。

	Blank Control	Sample Group
Ellman's Reagent Solution	180μl	180μl
Sample	0μl	20μl
Assay Buffer	20μl	0μl
Total Volume	200μl	200μl

注1：为获取更加可靠的检测结果，推荐每个样品设置2-3个平行孔。
注2：如果发现样品中巯基含量过高，超出标准曲线检测范围，可先酌情用Assay Buffer或裂解液对样品进行适当稀释，稀释倍数记录为n。如果样品中巯基含量过低，则在样品制备时使用更多的组织或细胞样品。
注3：上述推荐的测定体系为200μl，如果样品中的巯基浓度不是太低，完全可以把每种试剂的用量减半，包括3b的样品处理，这样试剂盒可以测定的总次数可以加倍。
d.用酶标仪测定412nm处的吸光度，测得的空白对照吸光度值，记录为ABlank，测得的样品或标准品吸光度值，记录为ASample，用ASample减掉ABlank，计算平均吸光度值，记录为ASample。
e.将ASample代入标准曲线，即可计算出巯基浓度(记录为B)。
f.根据实验需求在下表中选择适当的公式计算蛋白质半胱氨酸浓度C。

Calculation Method	Formula	Note
按样品质量计算	C (μmol/mg) = B × n × VSample / WSample × (CProtein-1 / CProtein-2)	VSample：细胞或组织裂解后的总体积(ml) WSample：样品质量(mg) CProtein-1：初始样品蛋白浓度(mg/ml) CProtein-2：处理后样品蛋白浓度(mg/ml)
按样品蛋白浓度计算	C (μmol/mg) = B × n / CProtein-2
按半胱氨酸浓度直接计算	C (mM) = B ×n×(CProtein-1 / CProtein-2)

g.计算示例：初始样品的蛋白浓度CProtein-1为1.6 mg/ml，步骤3样品处理后的样品的蛋白浓度CProtein-2经测定为1mg/ml，未经稀释，反应步骤3c中的孵育时间为15分钟，参考样品测定步骤进行测定。如果测出的ASample = 0.5，ABlank = 0.126，则ASample = 0.374，根据图2拟合的标准曲线公式：y = 0.4491x + 0.0766，计算出B = 0.6622mM，则样品中蛋白质半胱氨酸浓度C (µmol/mg) = 0.6622/1 =0.6622µmol/mg，样品中半胱氨酸浓度C (mM)=0.6622×(1.6/1)=1.06mM。
参考文献：
1.Rothstein A. Current topics in membranes and transport. Academic Press.1971.1: 135-176.
2.Ou S, Kwok K C, Wang Y, et al. Food Chemistry. 2004. 88(2): 317-320.
3.Shen Y, Zhong L, Markwell S, Cao D. Biochimie. 2010. 92(5):530-7.
4.Tang S, Li J, Huang G, Yan L. Protein Pept Lett. 2021. 28(8):938-944.
5.Chen X, Zhou Y, Peng X, Yoon J. Chem Soc Rev. 2010. 39(6):2120-35.
6.Riddles PW, Blakeley RL, Zerner B. Methods Enzymol. 1983. 91:49-60.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
S0138S	游离巯基检测试剂盒(DTNB法)	100-200次
S0138M	游离巯基检测试剂盒(DTNB法)	500-1000次
S0141S	总巯基检测试剂盒(DTNB法)	100-200次
S0141M	总巯基检测试剂盒(DTNB法)	500-1000次
S0145S	蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法)	100-200次
S0145M	蛋白质半胱氨酸检测试剂盒(DTNB法)	500-1000次
S0052	总谷胱甘肽检测试剂盒	100次
S0053	GSH和GSSG检测试剂盒	共100次