pET-N-His-TEV-QUEEN NA (ATP荧光探针对照质粒)
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产品编号 D2909-100μg
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¥ 1169.00
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1μg 100μg
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pET-N-His-TEV-QUEEN NA (ATP荧光探针对照质粒)是碧云天研发的一种用于在细菌中表达ATP荧光探针QUEEN2m或QUEEN7µ时,作为对照的原核工具质粒,可以用于活体实时检测单个细菌内ATP水平时的对照,也可以用于QUEEN NA的原核表达纯化。

通常本产品用作D2906 pET-N-His-TEV-QUEEN2m (细菌ATP荧光探针)D2907 pET-N-His-TEV-QUEEN7µ (高灵敏度细菌ATP荧光探针)的阴性对照使用。

本质粒N端His标签后含有TEV酶切位点,可通过TEV Protease (P2307/P2308)切除N端的His标签。

QUEEN (Quantitative Evaluator of Cellular Energy)是一个单一的环状排列的荧光蛋白(circularly-permuted fluorescent protein)和细菌ATP结合蛋白融合表达而成。QUEEN对细菌生长速率的改变不敏感(insensitive to bacteria growth changes)。许多细菌细胞内根据QUEEN的荧光所计算的胞内ATP浓度与根据萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)方法检测所计算得出的胞内ATP浓度几乎完全一致,因此QUEEN适合用于定量检测细菌内的绝对ATP浓度。从很多单个细菌收集的QUEEN荧光信号进行分析时发现,即使是遗传背景相同的大肠杆菌细胞,在相同培养条件下,细胞内的绝对ATP浓度也是不同的。

基因编码的ATP荧光探针QUEEN7µ荧光蛋白,由环型排列的增强型绿色荧光蛋白cpEGFP (circularly-permuted enhanced green fluorescent protein)插入到嗜热芽孢杆菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF1-ATP合成酶的ε亚基的两个α螺旋之间组成,在接头处分别由两个氨基酸的接头(TR和LG)进行连接。当ATP结合于FoF1-ATP合成酶的ε亚基的时候,会引起整个蛋白发生构象变化。激发波长400nm/发射波长513nm的荧光强度与激发波长494nm/发射波长513nm的荧光强度的比值对ATP的浓度变化做出响应。QUEEN7µ是一个高亲和力的ATP荧光探针(Kd~7µM at 25℃),但对ADP没有亲和力。对于正常的活细菌而言,QUEEN7µ对ATP的亲和力可能过高,而较难检测出较高浓度ATP水平的变化。但对于特定条件导致的细菌内低ATP水平时,比较适合使用QUEEN7µ进行ATP的荧光检测。也可以使用表达纯化的QUEEN7µ进行体外体系的ATP实时浓度检测。

基因编码的ATP荧光探针QUEEN2m荧光蛋白,是QUEEN7µ的突变体,通过用源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亚基的1-107aa取代QUEEN7µ中的源自嗜热芽孢杆菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF1-ATP合成酶ε亚基的1-107aa。仍然以激发波长400nm/发射波长513nm的荧光强度与激发波长494nm/发射波长513nm的荧光强度的比值对ATP的浓度变化做出响应。但QUEEN2m是一个低亲和力的ATP荧光探针,更适合检测ATP的生理浓度(Kd~4.5mM at 25℃)。高浓度的ADP会对QUEEN2m信号产生负面影响,但效果相对较小(在生理ADP浓度下约为10%或更少)。此外QUEEN2m信号在pH7.3-8.8和生理Mg2+浓度(1-2mM)范围内几乎不受影响。

基因编码的ATP探针QUEEN NA荧光蛋白,是QUEEN2m的突变体,使用源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亚基的110-132aa取代QUEEN2m中的源自嗜热芽孢杆菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF1-ATP合成酶ε亚基的110-133aa,并突变了两个位点(R122K/R126K),使QUEEN-NA失去了对ATP的亲和作用。因此QUEEN NA可用作QUEEN2m或QUEEN 7µ的阴性对照。

图1.QUEEN7µ、QUEEN2m和QUEEN NA的蛋白结构图。

本质粒含有T7启动子/lac操纵子,可以在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的蛋白表达。在多克隆位点的前面,带有一个His标签的编码序列,含有6个组氨酸(6X His)。

本载体在N端His标签与多克隆位点之间含有TEV蛋白酶(TEV Protease)识别的七肽序列ENLYFQG,对应的核酸序列为GAGAACCTGTACTTCCAAGGG,因此可在QUEEN NA蛋白纯化后用TEV蛋白酶切除N端His标签。TEV蛋白酶酶切发生在七肽序列的Q和G之间,因此在酶切去除His标签的时候目的蛋白的N端会留下一个额外的氨基酸残基G。

通常可以采用如BeyoGold™ His-tag Purification Resin (P2210/P2218/P2220)His标签蛋白纯化试剂盒(P2226)等纯化His标签的QUEEN NA,也可以使用His-tag抗体(AH367)检测和少量地分离纯化QUEEN NA。

本质粒为卡那霉素抗性。

pET-N-His-TEV-QUEEN NA质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
f1 origin 12-467
Kanamycin resistance ORF 563-1645
PBR 322 origin 2084
LacI coding sequence 3518-4597
T7 promoter 4988-5004
His tag coding sequence 5079-5096
TEV Protease recognition site sequence 5097-5117
QUEEN NA 5124-6269
T7 Terminator 6367-6413

pET-N-His-TEV-QUEEN NA质粒(6420bp)的图谱如下:

pET-N-His-TEV-QUEEN NA的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2909 pET-N-His-TEV-QUEEN NA (ATP荧光探针对照质粒).pdf

pET-N-His-TEV-QUEEN NA中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pET-N-His-TEV-QUEEN NA)包括:

AatII Acc65I AflII AgeI AhdI AscI AvrII
BaeI BbvCI BfuAI BmtI BsaI BsiWI BspMI
BstBI Bsu36I CspCI DraI EagI Eco53kI EcoRI
FseI HindIII KpnI MfeI MscI NcoI NheI
NotI PacI PmeI PmlI PspXI RsrII SacI
SacII SalI SbfI ScaI SexAI SfiI SnaBI
SpeI SrfI StuI SwaI ZraI

pET-N-His-TEV-QUEEN NA中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pET-N-His-TEV-QUEEN NA)包括:

AlwNI CAG,NNN`CTG 1729 NdeI CA`TA,TG 5074
AsiSI GCG,AT`CGC 943 NruI TCG|CGA 1286
BamHI G`GATC,C 5118 PaeR7I C`TCGA,G 6276
BclI T`GATC,A 4228 PciI A`CATG,T 2141
BglII A`GATC,T 6270 PflFI GACN`N,NGTC 2399
BmgBI CAC|GTC 6248 PpuMI RG`GWC,CY 3136
BseRI GAGGAG(N)8,NN` 5779 PshAI GACNN|NNGTC 3401
BspQI GCTCTTCN`NNN, 2258 PsiI TTA|TAA 370
BsrGI T`GTAC,A 5725 PstI C,TGCA`G 6222
BssHII G`CGCG,C 3831 PvuI CG,AT`CG 943
BstAPI GCAN,NNN`NTGC 4563 SapI GCTCTTCN`NNN, 2258
BstEII G`GTNAC,C 4060 SgrAI CR`CCGG,YG 4923
BstZ17I GTA|TAC 2374 SmaI CCC|GGG 1069
DraIII CAC,NNN`GTG 242 SphI G,CATG`C 4771
EcoRV GAT|ATC 5180 TspMI C`CCGG,G 1067
FspI TGC|GCA 3164 Tth111I GACN`N,NGTC 2399
HincII GTY|RAC 3740 XbaI T`CTAG,A 5034
HpaI GTT|AAC 3740 XhoI C`TCGA,G 6276
MluI A`CGCG,T 4242 XmaI C`CCGG,G 1067

pET-N-His-TEV-QUEEN NA的全序列信息:D2909 pET-N-His-TEV-QUEEN NA全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2909-1μg pET-N-His-TEV-QUEEN NA 1μg
D2909-100μg pET-N-His-TEV-QUEEN NA 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。
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