pCMV-Mito-AT1.03 (线粒体ATP荧光探针)
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pCMV-Mito-AT1.03 (线粒体ATP荧光探针)是碧云天自行研发的含有CMV启动子用于在哺乳动物线粒体中表达带有线粒体定位信号(Mitochondrial localization signal, MLS)的AT1.03蛋白以作为细胞线粒体ATP荧光探针的工具质粒。本质粒表达的ATP荧光探针被称为ATeam,即基于FoF1-ATP合成酶ε亚基的ATP指示剂(Adenosine 5'-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements)。AT1.03是一种低亲和力的ATeam (Kd=3.3mM at 37℃),可以检测毫摩尔级的ATP水平。pCMV-Mito-AT1.03质粒在转染哺乳动物细胞后,AT1.03蛋白由于带有线粒体定位信号主要分布在线粒体中,适合用于实时监控线粒体内的ATP浓度变化。

pCMV-Mito-AT1.03 (线粒体ATP荧光探针)也可以用作线粒体荧光探针,在活细胞中或细胞固定后标记线粒体的位置和形态。

AT1.03蛋白是以荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)为基础的实时监测单个活细胞内的ATP水平及其实时变化的ATP荧光探针。带有线粒体定位信号的该荧光探针由N端的青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein) mseCFPΔC11 (激发光波长435nm,发射光波长475nm)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亚基以及C端的黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein) cp173-mVenus (激发光波长515nm,发射光波长527nm)融合而成(参考图1)。枯草芽孢杆菌的FoF1-ATP合成酶的ε亚基是几乎最小的ATP结合蛋白(14kDa),它由一个N端β桶状结构域和两个C端α螺旋结构域组成。作为基于FRET的ATP荧光探针,FoF1-ATP合成酶的ε亚基具有几个突出优点:ε亚基与ATP结合,但不水解ATP;结合ATP,但不结合ADP、GTP、CTP以及UTP;当ATP结合时,ε亚基发生很大的构象变化形成一个折叠的构象(folded form),从而使N端的青色荧光蛋白以及C端的黄色荧光蛋白得以在空间上接近,而发生荧光共振能量转移(激发光波长435nm,发射光波长527nm)。带有线粒体定位信号的AT1.03蛋白和不带有线粒体定位信号的AT1.03蛋白相比,完全保留了AT1.03蛋白的以FRET为基础的ATP荧光探针的功能。

图1.Mito-AT1.03蛋白结构图,N端融合了线粒体靶向信号(细胞色素c氧化酶VIII双链体)。Cox x2为线粒体定位信号。

pCMV-Mito-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果请参考图2。

图2.pCMV-Mito-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果图。A图为明场照片,B图为荧光照片。

AT1.03的荧光信号在pH7.1-8.5之间非常稳定,这样AT1.03的荧光信号在正常细胞质内(pH7.3左右)几乎不会发生波动。ATP的结合常数Kon为1.7×10-2mM-1s-1,ATP的解离常数Koff为9.8×10-2s-1,因此AT1.03可用于监控细胞内高达0.1s-1 ATP的动态变化,特别适合用于实时监测超短时间内的ATP浓度变化。带有线粒体定位信号的AT1.03蛋白和不带有线粒体定位信号的AT1.03蛋白相比,pH稳定性、结合常数、解离常数等性能基本一致。

本质粒为卡那霉素抗性,转染细胞后,可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-Mito-AT1.03质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 1–602
T3 promoter and T3 primer binding site 620–639
Mito-AT1.03 699-2702
multiple cloning site 651-692/2703-2726
T7 promoter and T7 primer binding site 2749–2797
SV40 polyA signal 2809–3192
f1 origin of ss-DNA replication 3330–3634
bla promoter 3659–3783
SV40 promoter 3803–4141
neomycin/kanamycin resistance ORF 4176–4967
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 4968–5426
pUC origin 5555–6222

pCMV-Mito-AT1.03质粒(6274bp)的图谱如下:

pCMV-Mito-AT1.03的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2606 pCMV-Mito-AT1.03 (线粒体ATP荧光探针).pdf

pCMV-Mito-AT1.03中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-Mito-AT1.03)包括:

AclI AfeI AflII AgeI AhdI AscI AsiSI
BaeI BbsI BbvCI BlpI BsiWI BsmBI BspEI
BspQI BstEII BstZ17I EarI EcoNI Esp3I FseI
HindIII NruI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI
SalI SapI SbfI ScaI SgrAI SwaI XcmI
XmnI

pCMV-Mito-AT1.03中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-Mito-AT1.03)包括:

AccI GT`MK,AC 1600 NdeI CA`TA,TG 240
ApaLI G`TGCA,C 5908 NheI G`CTAG,C 597
BamHI G`GATC,C 687 NotI GC`GGCC,GC 668
BclI T`GATC,A 2963 PaeR7I C`TCGA,G 2709
BglII A`GATC,T 2703 PciI A`CATG,T 6222
BmgBI CAC|GTC 1940 PflFI GACN`N,NGTC 4422
BmtI G,CTAG`C 597 PflMI CCAN,NNN`NTGG 863
BsaI GGTCTCN`NNNN, 5293 PluTI G,GCGC`C 4303
BsaXI ,NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` 3353 PvuI CG,AT`CG 2807
BsrDI GCAATG,NN` 4535 RsrII CG`GWC,CG 4820
BsrGI T`GTAC,A 2158 SacI G,AGCT`C 651
BstBI TT`CG,AA 4986 SacII CC,GC`GG 660
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 663 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 4076
CspCI ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 380 SfoI GGC|GCC 4305
DraIII CAC,NNN`GTG 3419 SmaI CCC|GGG 682
Eco53kI GAG|CTC 653 SnaBI TAC|GTA 346
EcoRI G`AATT,C 1959 SpeI A`CTAG,T 2721
EcoRV GAT|ATC 1613 SrfI GCCC|GGGC 682
HincII GTY|RAC 3069 StuI AGG|CCT 4125
HpaI GTT|AAC 3069 TspMI C`CCGG,G 680
KasI G`GCGC,C 4303 Tth111I GACN`N,NGTC 4422
MfeI C`AATT,G 3056 XbaI T`CTAG,A 2715
MluI A`CGCG,T 3192 XhoI C`TCGA,G 2709
MscI TGG|CCA 4386 XmaI C`CCGG,G 680
NarI GG`CG,CC 4304

如需对pCMV-Mito-AT1.03质粒中插入片段Mito-AT1.03进行测序时,推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下:

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

T7 primer (2749–2797): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'

pCMV-Mito-AT1.03的全序列信息:D2606 pCMV-Mito-TA1.03全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2606-1μg pCMV-Mito-AT1.03 (线粒体ATP荧光探针) 1μg
D2606-100μg pCMV-Mito-AT1.03 (线粒体ATP荧光探针) 100μg
说明书 1份
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
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