NScience|快来学习，热点“焦亡” 又发顶刊！

结核病（Tuberculosis, TB）是一种由结核杆菌（Mycobacterious tuberculosis, Mtb）感染引起的具有很强传染性的疾病。据统计，每年大约有150万人死于结核病，而耐药结核杆菌的出现和传播加剧了这种情况。因为对结核病的发病机制知之甚少，抗结核新疗法的研发受到了严重的阻碍。结核杆菌是一种宿主细胞共存和共同进化的适应性的胞内病原体，已经进化出了很多利于自身长期感染的机制，比如结核杆菌进化出了一系列的真核样效应器 ，但它们在病原-宿主相互作用中究竟扮演什么角色仍然有待探索。

焦亡（Pyroptosis）是一种由gasdermin(GSDMD)介导的程序性细胞死亡， 越来越多的证据支持焦亡在哺乳动物感染中发挥关键作用，但病原体是如何躲过这种免疫反应，在很大程度上是未知的。

2022年10月14日，中国科学院微生物研究所刘翠华等研究人员合作在Science（IF:63.714）上发表了题为A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin的研究成果，该团队证明了一种来自结核杆菌的蛋白磷酸酶PtpB能够通过改变宿主细胞膜的组成抑制细胞因子释放和焦亡从而实现结核杆菌的免疫逃逸，为抗结核疗法的开发提供了新思路。

主要结果解读

首先，研究人员对Mtb H37Rv菌株进行了全基因组检测，筛选出了540个编码真核样基序或结构域蛋白的基因，进一步筛选出201个编码分泌蛋白的基因。通过ELISA检测发现6种Mtb蛋白(Rv0153c、Rv0561c、Rv0824c、Rv0861c、Rv1515c和Rv1679)对AIM2和NLRP3炎症小体重组HEK293T细胞IL-1β分泌具有很强的抑制作用，其中PtpB(即Rv0153)在Mtb感染期间分泌最为丰富。研究人员通过ELISA和免疫印迹分析进一步证实了PtpB对AIM2或NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌具有抑制作用，且缺失PtpB的Mtb突变株（(△ptpB）比野生型菌株（WT）表现出更强的焦亡相关反应，表明PtpB是宿主炎症小体-焦亡通路的重要抑制剂。

接下来，研究人员开始探究Mtb PtpB抑制炎症小体通路的具体机制。研究人员发现缺失PtpB的Mtb△ptpB菌株感染导致细胞内成熟的IL-1β、caspase-1(p20)和GSDMD-C减少（GSDMD-N增多），而上清中这些物质的含量增多，表明GSDMD可能是PtpB的靶点。随后，研究人员利用GSDMD敲除（Gsdmd^−/−）骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）来确定GSDMD是否是PtpB介导的焦亡通路的抑制所必需的。实验发现，野生型BMDM细胞中PtpB的缺失增加了成熟的IL-1β、caspase-1(p20)和GSDMD-C的分泌，降低了细胞内K⁺浓度，并且肿胀的泡状结构（swelling bubbles）增加（一种焦亡的标志），但是在Gsdmd^−/− BMDM中并没有这些现象。此外，PtpB以GSDMD依赖的方式抑制巨噬细胞在炎症小体激活时释放的两种重要炎症细胞因子IL-1β和IL-18的分泌。相反，PtpB以非GSDMD依赖的方式抑制巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-6，但不抑制IL-12(P40)或IL-10。在Mtb感染后的不同时间点，PtpB通过非依赖GSDMD的方式降低了Tnf和IL6的mRNA水平，表明PtpB参与Mtb对多种非炎症小体免疫通路的抑制。研究人员还发现，Mtb△PtpB菌株在Gsdmd^+/+ 的野生型BMDMs中的细胞内存活率与Gsdmd^-/- BMDMs中的细胞内存活率相比明显降低。结合外源性表达Mtb PtpB验证等实验数据表明，PtpB抑制了GSDMD依赖的炎症小体细胞因子的释放和焦亡，以维护Mtb的细胞内生存。

GSDMD-N是GSDMD的功能域，介导细胞因子的释放和炎症反应。研究人员通过产生稳定表达野生型人GSDMD（hGSDMD）或四种氨基酸突变的hGSDMD（Arg¹³⁷、Lys¹⁴⁵、Arg¹⁵¹、和Arg¹⁵³均突变为ALA以灭活GSDMD-N）Gsdmd^-/-永生化BMDMs去研究GSDMD-N在PtpB介导的抑制炎症途径中的作用。研究发现PtpB通过破坏GSDMD-N的膜定位阻止巨噬细胞细胞因子的分泌和焦亡。Cys¹⁶⁰→Ser(C160S)突变使PtpB的磷酸酪氨酸和磷脂酰肌醇磷酸酶活性降低，而K164A突变仅使PtpB的磷酸酪氨酸磷酸酶活性降低。研究人员利用PtpB C160s突变体和K164A突变体，通过共聚焦、ELISA等实验进一步发现PtpB是依赖Cys160的脂磷酸酶活性来破坏GSDMD-N的膜定位的，且研究人员进一步发现PtpB通过降低细胞膜PI4P和PI(4,5)P2浓度，损害GSDMD介导的免疫功能。

最后，研究人员开始研究PtpB是如何有效地降低宿主细胞膜PI4P和PI(4,5)P2浓度来损害GSDMD功能的。对PtpB和Ub相互作用的结构分析显示，PtpB含有一个泛素（Ub）相互作用基序(UIM)样区域，其疏水表面包括一个α螺旋(即螺旋α9)上的三个关键UIM残基(Ala²⁴⁰-Ala²⁴²)，该螺旋可能与Ub中的Ile⁴⁴残基结合。为了证实这个类似UIM的区域是否介导了PtpB和Ub之间的相互作用，研究人员产生了Ala²⁴⁰-Ala²⁴² 突变为 Glu的PtpB突变体(PtpB 3E)（该突变体可以在保留α螺旋的前提下破坏疏水表面），发现PtpB在体外直接与Ub结合，并且在细胞内与Ub相互作用，而PtpB 3E或Ub I44A突变破坏了它们的相互作用。此外，PtpB只能与单Ub相互作用而不与多Ub链相互作用。研究还发现，Ub增加了野生型PtpB的催化效率，但没有增加其3E突变体的催化效率，且Ub结合对PtpB去磷酸化宿主磷脂酰肌醇以抑制GSDMD介导的免疫应答至关重要，结合多种实验数据表明，在结核分枝杆菌感染过程中，PtpB破坏GSDMD介导的免疫反应需要Ub结合，且通过动物模型发现，破坏PtpB的泛素结合区域可以增强感染早期宿主依赖GSDMD的抗感染保护性免疫反应，并减轻感染晚期宿主的病理性免疫损伤，进一步证实PtpB-Ub相互作用是Mtb逃避宿主GSDMD依赖免疫所必需的。

研究结论

该团队鉴定出了Mtb分泌的蛋白磷酸酶PtpB是宿主炎症小体-细胞焦亡通路的潜在抑制因子，并且发现PtpB在Mtb感染时通过真核样泛素结合模序与宿主泛素结合并被激活，使宿主细胞质膜上的PI4P与PI(4,5)P2发生去磷酸化，抑制GSDMD-N在细胞膜上的聚集，阻止细胞因子IL-1β和IL-18的释放，最终抑制细胞焦亡。此外，研究人员还证实了破坏PtpB的脂磷酸酶活性或泛素结合区域可以显著增强宿主在感染早期依赖GSDMD的保护性免疫反应及清除Mtb的能力，并减轻宿主在感染晚期的病理性免疫损伤。

使用产品

本项研究中，该团队使用了Western及IP细胞裂解液（P0013）、RIPA裂解液（P0013B/C/D）、Hanks' Balanced Salt Solution（C0218）、DAPI染色液（C1006）及Propidium Iodide/碘化丙啶（ST512）多款碧云天产品。

产品信息

产品编号	产品名称	产品包装
P0013	Western及IP细胞裂解液	100ml
P0013B	RIPA裂解液(强)	100ml
P0013C	RIPA裂解液(中)	100ml
P0013D	RIPA裂解液(弱)	100ml
C0218	Hanks' Balanced Salt Solution	500ml
C1006	DAPI染色液	50ml
ST512	Propidium Iodide/碘化丙啶	20ml