使用说明：
1. 样品的准备：
a. 细胞样品的准备：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用
   EDTA处理细胞或用细胞刮子收集细胞。细胞用PBS或生理盐水洗涤一遍。后续a1和a2步骤可以任选其
   一(优先推荐步骤a1)：
   a1.可以用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)参考相应说明裂解细胞样品。按照每100万细
   胞加入100-200微升裂解液的比例进行裂解。如果出现裂解效果不佳的情况，可以把处在裂解液中的
   细胞样品用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。随后4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。
   a2.可以用本试剂盒中的匀浆液，按照每100万细胞加入100-200微升匀浆液的比例用玻璃匀浆器在4℃
   或冰浴匀浆。随后4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。进行匀浆处理。
b. 组织样品的准备：动物用含有0.16mg/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml
   heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照约每20mg组织加入200微升匀浆液的比例，用玻璃匀浆
   器在4℃或冰浴匀浆。4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。
c. 红细胞裂解液的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少500微升全血4℃ 2500g离心5分钟。
   弃上清，用冰冷的约红细胞沉淀10倍体积的匀浆液重悬沉淀，再同前离心，弃上清。加入约红细胞沉
   淀4倍体积的冰冷的Milli-Q级纯水裂解红细胞。12000g离心5分钟，取上清。
d. 上述各种样品可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/
   P0012S)测定蛋白浓度。通常可以先取含20-100微克蛋白的样品用于检测。如果发现样品中谷胱甘肽
   过氧化物酶的活力过高，可以用谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液进行稀释。如果样品中谷胱甘肽过氧
   化物酶的活力过低，则需适当加大蛋白用量。准备好的样品如果当日测定，可以在冰浴保存，如果日
   后测定可以-70℃冻存。
2. 试剂盒的准备工作：
a. 配制10mM NADPH。取2.5mg NADPH，加入300微升Milli-Q级纯水或重蒸水，溶解，混匀。预计多余的
   NADPH需立即分装，-70℃保存。
b. 84mM GSH溶液的配制。在14mg GSH中加入550微升 Milli-Q级纯水，溶解并混匀。或称取少量GSH，配
   制少量84mM GSH溶液。预计多余的GSH需立即分装，-20℃保存。
c. GPx检测工作液的配制。根据待测定的样品数(含对照)，参考下表配制适当量的GPx检测工作液。配制
   好的GPx检测工作液仅限当日使用，且需尽量在冰浴上存放。

d. 15mM过氧化物试剂溶液的配制。取21.5微升过氧化物试剂(t-Bu-OOH)加入10毫升Milli-Q级纯水，混
   匀，即配制成15mM过氧化物试剂溶液。配制好的15mM过氧化物试剂溶液仅限当日使用，且需尽量在冰
   浴上存放。
e. 所有试剂使用前须在水浴中或PCR仪等设备上温育到25℃。
3. 样品测定：
   表1

a. 参考表1，依次加入检测缓冲液、待测样品和GPx检测工作液，混匀。加入4微升15mM过氧化物试剂溶
   液后，反应开始。需适当混匀，可以使用培养板振荡器。
b. 使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A₃₄₀。如果仪器可以设置温度，把温度设置在25℃，否
   则可以通过空调调节室温到25℃，待预计仪器也达到25℃后再开始测定A₃₄₀。
c. 连续测定3分钟或自动每隔30秒测定一次A₃₄₀。如果仪器不具备相应功能，可以手工操作，每隔30秒
   记录A₃₄₀值，至少连续记录3分钟，获得6个点的数据。前15秒的数据由于反应体系需要混合等原因，
   数据可能不太准确，需弃掉。
d. 第一次测定时建议做1-2个样品本底对照，如果样品本底对照和空白对照非常接近，则说明样品中不
   存在干扰物质，后续检测类似样品时，可以不再检测样品本底对照。如果样品本底对照和空白对照有
   显著差异，则每个样品在测定时多需做样品本底对照。计算时每个样品的A₃₄₀/min都需要扣除相应的
   样品本底对照测定出来的A₃₄₀/min。
e. 测定出来的A₃₄₀/min最好能控制在0.03-0.15范围内。如测定出来的A₃₄₀/min数值过大，则可以把样
   品适当稀释，如A₃₄₀/min数值过小，处理样品时需设法尽量浓缩样品。
4. 样品中谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的计算：
a. 谷胱甘肽过氧化物酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(1unit)在25℃，pH8.0，在GSH、谷胱甘肽还
   原酶、t-Bu-OOH存在的条件下，在1分钟内可以催化1微摩尔NADPH转变成NADP+。1 U=1000 mU。
b. 对于谷胱甘肽过氧化物酶溶液：1mU/ml＝1nmol NADPH/min/ml＝(A₃₄₀/min)/0.00622
   即相当于：[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]=[A₃₄₀/min(sapmle)－A₃₄₀/min(blank)]
   /0.00622
   注：[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为mU/ml。
c. [样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]＝[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力] X[稀释倍数]/
   [样品中的蛋白浓度]
   [样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为：U/mg蛋白或mU/mg蛋白；
   [样品中的蛋白浓度]的单位为：mg/ml。
d. 计算示例：样品的蛋白浓度经测定为0.5mg/ml，用样品稀释液稀释2倍后，取10微升稀释后的样品参
   考表1进行测定。如果A₃₄₀/min(sapmle)＝0.065，A₃₄₀/min(blank)＝0.003，那么
   [检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]= (0.065-0.003)/0.00622=10mU/ml
   [样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]= 10mU/mlX2X20/(0.5mg/ml)=800mU/mg(蛋白)

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